龙脑樟乙酸乙酯部位的抗炎及抗肿瘤活性研究

曹明原，吴静，顾震，吴磊，彭建军

（1.江西省科学院 应用化学研究所，江西南昌 330096；2.江西农业大学 食品科学与工程学院，江西南昌 330000；3.江西樟乡天然冰片有限责任公司，江西吉安 343000）

龙脑樟（Cinnamomum camphora chvar. Borneol）为樟科（Lauraceae）樟属（Cinnamomum）的一种香樟树，1987年首次发现于江西省吉安市，目前主要在江西、湖南两地有所种植，资源较为稀缺[1-2]。龙脑樟因富含右旋龙脑（天然冰片），在中医典籍中被归于芳香开窍类药材，民间常将其用于醒目通窍、解郁散火、祛风解表、化湿和中[2]。龙脑樟中含有萜类、苯丙素类、挥发油类及黄酮类等化合物，具有抗炎、降血糖、抗菌、杀虫、抗肿瘤及抗氧化等药理活性[3-8]。目前对龙脑樟的研究多数集中在龙脑樟叶的化学成分、挥发油和天然冰片的提取[9-11]，对龙脑樟的采后剩余部分（如龙脑樟枝）的研究较少，这不仅对龙脑樟资源造成了浪费，还降低了对龙脑樟资源的综合利用率。因此，本实验通过脂多糖（Lipopolysaccharid，LPS）刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞建立体外炎症模型，以炎症介质NO的产生量为指标研究龙脑樟的抗炎活性，并通过MTT法研究龙脑樟对SH-SY5Y神经瘤细胞及HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用，以期为进一步开发龙脑樟资源，提高龙脑樟资源的整体利用率提供理论基础及参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DMEM高糖培养基（批号：AE29461773），美国HyClone实验室；NTC胎牛血清（批号：NTC-HK026），阿根廷Natocor工业；青链霉素（批号：G507FA0001）、0.4%台盼蓝染色液（批号：G616FA0001）、噻唑蓝（MTT）（批号：A600799-0005）、胰蛋白酶细胞消化液（批号：H617FA0003）、PBS缓冲液（批号：G429FA0001），上海生工生物工程股份有限公司；亚硝酸钠、盐酸萘乙二胺、磺胺、十二烷基硫酸钠，上海凛恩科技发展有限公司；脂多糖（LPS）、二甲基亚砜（DMSO），北京索莱宝科技有限公司；其余试剂均为分析纯，天津致远化学股份有限公司。

龙脑樟枝，由江西樟乡天然冰片有限责任公司提供，经江西省科学院应用化学研究所李雄辉研究员鉴定为龙脑樟枝，样本编号为PML202102；RAW264.7小鼠巨噬细胞、SH-SY5Y神经瘤细胞及HepG2肝癌细胞，由云南农业大学提供。

1.2 仪器与设备

Esco CellMate二氧化碳培养箱，新加坡Esco科技有限公司；尼康ECLIPSE Ts2倒置显微镜，日本NIKON公司；Tecan INFINITE 200PRO酶标仪，TECAN Austria有限责任公司；TD50002A电子天平，上海衡际科学仪器有限公司；Milli-Q超纯水器，密里博公司；RE52CS-1旋转蒸发器、B-260恒温水浴锅，上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；DLSB-10L/10低温冷却液循环泵，巩义市予华仪器有限责任公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的提取制备

将龙脑樟枝彻底干燥后粉碎，取粉碎后的龙脑樟枝2.4 kg，按15：1（kg：L）料液比加入80%的乙醇超声（400 W，30 min）重复提取2次，之后进行抽滤，旋转蒸发，减压浓缩后得到龙脑樟枝乙醇粗提物（Crude，242.42 g），将粗提物加入适量水混合后，用乙酸乙酯萃取，之后进行旋转蒸发、减压浓缩得到乙酸乙酯萃取部位浸膏。用活性炭对乙酸乙酯部位浸膏进行脱色处理，之后冷冻干燥，得到纯化后的乙酸乙酯部位样品（11.82 g）。取适量乙酸乙酯部位样品加入DMSO配制成100 mg/mL的母液，放于4 ℃冰箱便于后续实验。

1.3.2 细胞培养

将RAW264.7细胞接种在含有10%胎牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM高糖培养基中，于37 ℃、5%CO2条件下培养。细胞生长至80%左右时，进行传代培养。SH-SY5Y细胞及HepG2细胞培养方式同上。

1.3.3 抗炎活性测定

（1）Griess法测定NO的释放量。以NaNO2为标准品，参考BEAK等[12]的方法绘制NO标准曲线。取对数生长期且生长状态良好的RAW264.7细胞，以5×105个/mL的浓度接种于96孔板中，每孔200 μL（四周边缘用等体积的PBS缓冲液填充），于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。然后弃去孔内旧培养液，设置空白组（只含培养液而无细胞，用于调零）、对照组、LPS模型组和药物组。空白组及对照组加入200 μL培养液（0.1% DMSO），LPS模型组加入200 μL含LPS培养液（0.1% DMSO），药物组先分别加入含不同浓度龙脑樟枝乙酸乙酯部位的培养液150 μL预处理2 h，再加入50 μL含LPS培养液，每组均设6个复孔，继续在培养箱中孵育24 h。之后每孔取上清液100 μL于96孔板中，加入100 μL配制好的Griess试剂，室温下反应10 min，在酶标仪540 nm处测定吸光值并代入NO标准曲线计算NO浓度。上述条件中所加药物终浓度分别为6.25 μg/mL、12.50 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL 及 100.00 μg/mL，LPS终浓度为1 μg/mL。

（2）MTT法测定细胞存活率。参考YANG等[13]测定细胞存活率。接板条件及模型设置同1.3.3（1），加入LPS及药物孵育24 h后，吸出孔内培养液，再加入100 μL 1 mg/mL的MTT培养液培养4 h，最后加入MTT终止液继续培养16～20 h，于570 nm处测定其吸光度并按公式（1）计算存活率。

（3）抗肿瘤活性测定。设置空白组、对照组及药物组，药物组加入不同浓度药物孵育48 h后吸出孔内培养液，加入MTT并按1.3.3（2）所示的方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 细胞毒性及NO释放量测定

LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，可作用于宿主细胞细胞膜表面上的Toll样受体4刺激细胞产生炎症[14]。NO可调节炎症和宿主防御并参与到各种慢性疾病中，是一种重要的炎症介质，NO的释放量也是评价药物抗炎活性的一项重要指标[15]。龙脑樟枝抗炎活性的测定如图1（a）、图1（b）所示。在没有加入LPS时，对照组中的NO含量极低，仅有1.28 μmol/L，属于正常水平。经过1 μg/mL的LPS刺激后，炎症反应启动，NO含量显著升高（LPS组32.08 μmol/L），表明炎症模型构建成功。通过给予细胞不同浓度的药物处理，结果表明，浓度为6.25～100.00 μg/mL范围内的样品均显著降低了NO含量，表明龙脑樟枝乙酸乙酯部位有较好的抗炎活性。然而，细胞毒性实验表明，浓度为12.50～100.00 μg/mL范围内的样品都显著地降低了细胞的存活率，表明其对细胞都有不同程度的毒性作用。只有浓度为6.25 μg/mL时，样品对RAW264.7细胞无明显毒害作用且能够显著降低NO的含量，表明低剂量浓度的龙脑樟枝有较好的NO抑制作用，抗炎活性较强。

图1 龙脑樟枝乙酸乙酯部位抗炎活性的测定结果（±SD，n=6）

2.2 抗肿瘤活性测定

龙脑樟乙酸乙酯部位对SH-SY5Y神经瘤细胞及HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用如图2（a）与图2（b）所示。6.25～25.00 μg/mL的样品对HepG2细胞及SH-SY5Y细胞的存活均无明显抑制作用，随着浓度增大为50.00～100.00 μg/mL时，龙脑樟枝均能极显著抑制HepG2细胞及SH-SY5Y细胞的增殖，表现出一定的剂量效应关系，且抑制率均在75%以上，表明龙脑樟枝对SH-SY5Y及HepG2细胞有潜在的抗肿瘤活性。

图2 龙脑樟枝乙酸乙酯部位抗肿瘤活性测定结果（±SD，n=6）

3 结论

结果表明，低剂量的龙脑樟枝乙酸乙酯部位可显著抑制炎症介质NO的释放，有一定的抗炎活性；中等剂量的样品对SH-SY5Y神经瘤细胞及HepG2肝癌细胞的增殖有显著的抑制作用，表明了龙脑樟枝的潜在抗肿瘤活性。研究为后续活性导向下的单体化合物分离提供了参考，也为提高龙脑樟资源的综合利用率提供了理论基础。目前关于其具体抗炎机制及抗肿瘤机理尚不清楚，可在后续的实验中深入研究。