巴西菇水提物对高脂大鼠血糖血脂的影响

李新明，张雅君，郭尚，郭潇飞

（山西农业大学 山西功能食品研究院，山西太原 030000）

肥胖在临床上被认为是一种代谢综合征，主要表现在能量消耗、能量摄入和能量代谢紊乱。长期高脂高糖饮食是肥胖的主要诱因，一些疾病（如高血压、高血脂、肾脏疾病等）与肥胖有着紧密的关系。高脂高糖饮食导致的高脂血症，是冠心病、心肌梗死、心脏猝死、脑卒中及动脉粥样硬化等心脑血管疾病发病的潜在危险因素，严重威胁着人类、尤其是老年人健康[1-3]。近年来，对天然提取物潜在健康效应的研究发现了一系列相关的生物活性，包括抗氧化[4]、抗高脂血症[5]和抗肥胖[6]等作用。

巴西菇（Agaricus blazeiMurill）又称姬松茸，属于伞菌目蘑菇科蘑菇属[7]。巴西菇不仅味道鲜美，还具有药理功效。巴西菇水提物具有许多药理学功效，如抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗突变、抗病毒、抗衰老及抗炎症等，还具有降血糖、降血脂、抗辐射、美容、抗过敏、预防心脑血管系统疾病及抑制细胞凋亡等功效[8-10]。

本文主要研究了巴西菇对高脂血症大鼠血脂、氧化应激的影响，通过测定相关数据观察了其在预防及治疗血脂方面的效果。

1 材料与方法

1.1 材料

巴西菇，购自太原集市。

1.2 试剂与仪器

TBA-40FR全自动生化分析仪，日本东芝公司；AL-204电子分析天平，瑞士METTLER-TOLEDO 公司；SOD试剂盒，E-30266，上海恒远生物科技有限公司；MDA试剂盒，E-30265，上海恒远生物科技有限公司；GSH-Px试剂盒，E-31036，上海恒远生物科技有限公司；NANODrop2000紫外分光光度计，赛默飞世尔。

1.3 实验方法

1.3.1 巴西菇水提物的制备

采用超声波辅助水提醇沉法对巴西菇进行提取[11]。取干燥巴西菇，去除杂质，粉碎，过40目筛。按照固液比1∶10（g∶mL）加入蒸馏水混合搅拌，超声波功率为400 W，60 ℃中提取50 min，重复3次。合并提取液，放在4 ℃的冰箱中静置12 h，上清液用4层纱布过滤后离心。上清液用85 ℃水浴浓缩，浓缩液用Sevag法去除蛋白2次，按6倍量加无水乙醇进行沉淀，置于-20 ℃的冰箱中过夜，舍弃上清液收集沉淀，真空冷冻干燥后得到巴西菇水提取物。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制率测定

取80 μL的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH=6.8）于96孔板中，再加入20 μL样品溶液，100 μL的α-葡萄糖苷酶（0.5 U/mL）溶液，并在37 ℃摇床中孵育20 min后，加入50 μL的PNPG（5 mmol/L）溶液，并用酶标仪分别于0 min和5 min时，在405 nm处测定吸光度[12]。抑制率计算公式为：

式（1）中：A1样品、A0样品分别为样品在 5 min、0 min时的吸光度；A1对照、A0对照分别为对照在5 min、0 min时的吸光度。

1.3.3 α-淀粉酶抑制率测定

采取3,5-二硝基水杨酸比色法测定α-淀粉酶的抑制作用[13]。取200 μL样品溶液于试管中，依次加入128 μL蒸馏水、160 μL的α-淀粉酶（1 U/mL）溶液，在37 ℃摇床中孵育5 min后，加入0.5%淀粉溶液320 μL和200 μL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH=6.8），在37 ℃下反应10 min。再从中取出200 μL溶液于试管中，加入100 μL3,5-二硝基水杨酸（DNS）终止液，沸水浴15 min，取出冷却后加入900 μL蒸馏水，混匀后取出200 μL于96孔板中，在540 nm下测定吸光值。以200 μL样品的溶剂代替样品，加入0.5%淀粉溶液288 μL和DNS溶液100 μL作为空白；以200 μL样品的溶剂代替样品，加入128 μL的蒸馏水，160 μL的α-淀粉酶（1 U/mL）溶液，100 μL的DNS终止液作为对照。测定吸光值，并按式（2）计算抑制率。

式（2）中：A1、A2、A3分别为550 nm下样品管、空白管、对照管的吸光值。

1.3.4 蔗糖酶抑制率测定

试管中加入0.5 mL 2%蔗糖溶液，加入1.0 mL 40 mg/L的样品溶液到抑制管和抑制对照管中，1.0 mL蒸馏水加入空白管和空白对照管中。之后，将0.5 mL蔗糖酶（20 U/mL）分别加入空白管和抑制管，0.5 mL蒸馏水加入对照管，在37 ℃下水浴10 min。接着加入1.0 mL DNS，5 min沸水浴后再加入10.0 mL蒸馏水。降低至室温，在550 nm处测定吸光值[14]，并按式（3）计算抑制率。

式（3）中：A4、A5、A6、A7分别为550 nm下空白管、空白对照管、抑制管和抑制对照管的吸光值。

1.3.5 高脂大鼠模型建立及药物处理

实验SD大鼠40只，随机分为5组，每组8只，分别为基础对照组、模型对照组、巴西菇水提取物低、中、高剂量组，每天定时喂食，自由饮水。基础对照组喂食基础饲料，高脂模型对照组喂食高脂饲料，巴西菇水提取物剂量组按照10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg的低、中、高剂量每天灌胃一次，同时每天定时喂食高脂饲料，自由饮水，连续饲喂40 d。

高脂饲料由1%胆固醇、10%猪油、10%蛋黄粉和79%基础饲料组成。

在第41天从鼠股静脉取血、2 000 r/min离心20 min分离血清。血脂指标（TG、TC、LDL-c、和HDL-c）的测定使用全自动生化分析仪来检测。按照FFA试剂盒说明测定FFA水平。附睾脂肪组织的处理参考文献[15]进行。

1.3.6 肝、肾组织中MDA和抗氧化酶活力的分析

各处理组大鼠进行处死，取出肝脏、肾脏来制备组织匀浆，按试剂盒说明书操作过程分别测定肝、肾组织中MDA、SOD、CAT和GSH-Px活力值。

1.3.7 脂肪系数的分析计算

式（4）中：m1为睾脂总数，g；m2为鼠的体重，g。

1.3.8 测定空腹血糖、胰岛素和胰岛素敏感指数

分别参照空腹血糖、胰岛素试剂盒说明书测定空腹血糖和胰岛素水平。

按照空腹血糖和胰岛素浓度的测定数据，通过公式（5）计算胰岛素敏感指数（Insulin Sensitive Index，ISI）。

式（5）中：ISI表示胰岛素敏感指数；FBG表示空腹血糖的浓度，mmol/L；INS表示胰岛素浓度，mIU/L。

1.3.9 UCP-1及PPAR-γ mRNA的表达

（1）肝、肾组织的总RNA提取。按照说明书，采用RNA提取试剂盒（离心柱型）来提取总RNA，浓度及纯度经紫外分光光度计分析，不符合标准样品被去除。

（2）cDNA合成。cDNA使用逆转录试剂盒合成，所有过程按照试剂盒说明书进行，反应体系总体积20 μL，每个体系试样含2 μL 10×RT缓冲液、1 μg RNA、2 μL 随机引物、0.8 μL dNTP、1 μL 逆转录酶；反应程序为：25 ℃ 10 min、37 ℃120 min、85 ℃5 min，之后取出样品，在-20 ℃保存。

（3）PCR扩增。总反应体系（10 μL）为cDNA模 板 2 μL，TaqManRMaster 5 μL，ddH2O 2.5μL、引物0.5 μL（序列见表1）。反应程序为：95 ℃10 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 20 s，共 40 个循环；72 ℃ 5 min。每个qPCR重复3次，以β-actin作为内参照基因，目的基因的相对表达量通过公式2-△△Gt计算。

表1 各基因引物碱基序列

2 结果与分析

2.1 巴西菇水提物对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和蔗糖酶的影响

巴西菇水提物对α-葡萄糖苷酶的影响如图1所示，在一定浓度范围内巴西菇水提物对α-葡萄糖苷酶的活力有明显的抑制效果，随着质量浓度的增大而增大。当浓度为7 mg/mL时，α-葡萄糖苷酶抑制率为78.9%。

图1 巴西菇水提物对α-葡萄糖苷酶的影响

巴西菇水提物对α-淀粉酶的影响如图2所示，在一定浓度范围内巴西菇水提物对α-淀粉酶有较好的抑制，随着质量浓度的增大而增大。当浓度为7 mg/mL时，α-淀粉酶抑制率为84.92%。

图2 巴西菇水提物对α-淀粉酶的影响

巴西菇水提物对蔗糖酶的影响如图3所示，在一定浓度范围内巴西菇水提物对蔗糖酶有显著的抑制，随着质量浓度的增大而增大。当浓度为7 mg/mL时，蔗糖酶抑制率为92.17%。

图3 巴西菇水提物对蔗糖酶的影响

2.2 巴西菇水提物对高脂大鼠血脂和氧化应激的影响

如表2所示，高脂膳食（HFD）组大鼠血液中TC、TG、LDL-c和FFA水平较正常膳食组显著增加HDL-c水平显著降低，（P＜0.01）。与HFD组比，HFD+巴西菇水提物组大鼠血液中TC、TG和FFA水平含量显著升高（P＜0.05，P＜0.01），HDL-c水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01），且随着巴西菇水提物剂量的增加而增加或降低，有明显的量效关系。

表2 巴西菇水提物对实验大鼠血脂水平的影响

如表3所示，HFD组大鼠体重和脂肪系数较正常膳食组显著增加（P＜0.01）。与HFD组比，HFD+巴西菇水提物组大鼠体重和脂肪系数显著降低（P＜0.05，P＜0.01），且随着巴西菇水提物剂量的增加而增加或降低，有明显的量效关系。

表3 巴西菇水提物对实验大鼠体重、脂肪系数的影响

由表4数据可知，与正常膳食对照组相比，高脂膳食模型组空腹血糖和胰岛素水平增加，而胰岛素敏感指数降低，有显著性差异（P＜0.01）；与高脂膳食模型组相比，HFD+巴西菇水提物组的大鼠空腹血糖和胰岛素水平下降，而胰岛素敏感指数增加，具有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01），而且随着巴西菇水提物剂量的增加，这一变化越显著（P＜0.01）。

表4 巴西菇水提物对实验大鼠血糖、胰岛素水平和胰岛素敏感指数的影响

与正常膳食组比，高脂膳食能引起大鼠肝、肾中抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活力显著降低（P＜0.01），MDA水平上升；与HFD组比，巴西菇水提物干预后，均显著提高了大鼠肝、肾中SOD、CAT和GSH-Px活力（P＜0.05，P＜0.01），降低了MDA水平，而且这些酶活力增长与药物剂量的增加而呈正比例关系（表5，表6）。

表5 巴西菇水提物对实验大鼠肝脏抗氧化水平的影响

表6 巴西菇水提物对实验大鼠肾脏抗氧化水平的影响

与正常膳食组比，高脂膳食能引起大鼠肝、肾中PPAR-γ mRNA水平显著上升和UCP-1 mRNA水平显著降低（P＜0.01）；与HFD组比，巴西菇水提物干预后，显著降低了大鼠肝PPAR-γ mRNA表达水平、提高了肾中UCP-1 mRNA表达水平（P＜0.05，P＜0.01），见表7。

表7 巴西菇水提物对实验大鼠肝、肾脏PPAR-γ mRNA和UCP-1 mRNA水平的影响

3 讨论

α-葡萄糖苷酶、蔗糖酶、淀粉酶是与血糖代谢有着紧密关系的3种酶[16]。本体外实验发现巴西菇水提物对3种酶均能发挥良好的抑制效果。

心、脑血管疾病的发生、发展与脂代谢紊乱有着紧密的关系，主要的生理生化显示在血清中TC、TG、LDL-c水平的升高与HDL-c的降低这几个方面。许多实验表明脂代谢紊乱与长期高脂膳食的摄取有关[17]。本实验通过饲喂大鼠高脂饲料建立高脂血症动物模型，模拟人类高脂膳食导致的脂代谢异常，然后通过巴西菇水提取物饲喂干预，观察其对高脂膳食诱导的大鼠脂代谢紊乱的影响。作为药食同源的蘑菇，巴西菇显示出较好的改善高脂血症的效果[18-19]。在本实验中，巴西菇水提物可以改善高脂膳食鼠的TG、TC、LDL-c、FFA及HDL-c等血脂指标，进而改善了血脂紊乱。同时，巴西菇水提物降低了高脂膳食大鼠空腹血糖和胰岛素水平，提高了胰岛素敏感指数。这些都表明巴西菇有着良好的降血糖血脂的功效。

在生物机理正常的情况下，抗氧化系统处于良好的平衡状态，然而，在发生疾病时，生物机体的氧化水平与抗氧化水平间的平衡就会被破坏。大量研究表明，长期的高糖高脂膳食摄取会诱导生物机体自由基蓄积，造成抗氧化水平的降低，从而诱发各种疾病[20-21]。SOD、CAT和GSH-Px是生物体内清除自由基的重要酶，能有效维护机体氧化与抗氧化的平衡。因此，机体中SOD、CAT和GSH-Px水平的高低与机体抗氧化的能力成正比。MDA是细胞膜不饱和脂肪酸过氧化反应产生的，是机体内脂质过氧化的重要指标，MDA水平的变化表现脂质过氧化作用的程度，间接显示出细胞的受损程度[22-24]。本实验结果表明，饲高脂膳食的大鼠体内抗氧化酶水平降低，巴西菇水提物能显著增强高脂膳食大鼠肝脏、肾脏中SOD、CAT和GSH-Px活性，降低肝脏、肾脏中MDA含量，提高机体的抗氧化能力。

脂肪组织中PPAR-γ在脂肪细胞分化、协调脂类代谢相关基因过程中具有重要作用，PPAR-γ受体的活化可促进脂肪组织中脂肪酸的利用[24]。模型组鼠的肝脏PPAR-γ mRNA的相对表达量较高，这可能与鼠脂肪酸水平较高有关。PPAR-γ活化使转运至肝脏的脂肪酸减少，脂肪合成量降低。与模型组比，巴西菇水提物低、中、高剂量组鼠脂肪组织中PPAR-γ mRNA的相对表达量下降，表明巴西菇水提物可有效降低高脂鼠肝脏脂肪沉积。这些作用可能与PPAR-γ mRNA的表达调节有关。

线粒体内膜蛋白UCP-1能够降低线粒体内膜两侧的跨膜质子浓度差，减低利用质子浓度差驱动的氧化磷酸化过程的速度，抑制三磷酸腺苷（ATP）的产生；UCP-1可作为检验棕色脂肪存在及功能活跃与否的指标[25-26]。外界刺激能促进甘油三酯脂肪酶分解甘油三酯释放出脂肪酸，脂肪酸被转移到线粒体产生热量或进入细胞核以增加UCP-1的表达并激活棕色脂肪的活性。本实验中肥胖大鼠经巴西菇水提物干预后，肾周脂肪组织UCP-1 mRNA表达明显增加，这可能是巴西菇水提物的干预抑制了肥胖大鼠白色脂肪细胞的成脂，并且保护了其糖脂代谢平衡。

4 结论

巴西菇水提物具有降脂、预防肥胖、改善机体氧化应激的作用。另外，巴西菇水提物改善脂代谢与它对PPAR-γ mRNA和UCP-1 mRNA表达水平有关，该作用存在量效关系，这为巴西菇的开发利用提供一定的科学依据。