氟喹诺酮C-3芳苄叉基不饱和酮的合成及抗肿瘤活性研究

赵梦涛，曹智威，冯亚莉，胡国强,2*

（1.郑州工业应用技术学院，河南省水环境与健康工程技术研究中心，河南郑州 451150；2.河南大学 临床医学院，河南开封 475001）

新药研发是一项高投入、高风险、高耗时的复杂智力创新过程，而基于理性药物设计原理，利用现有药物的优势骨架或药效团构建结构新颖的化合物库，并通过活性筛选发现有苗头的化合物是新药研发最经济有效的策略[1]。α,β-不饱和酮结构单元不仅可作为重要的活性有机合成子参与构建结构多样的功能有机化合物，同时作为天然查尔酮和黄酮类的特征药效团骨架，因其可与大分子配体发生络合及迈克尔加成反应而产生广泛的药理活性，已成为多种临床药物（如小分子靶向酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼[2]和利尿药依他尼酸[3]及众多候选药物）的优势药效团骨架。另外，拓扑异构酶不仅是氟喹诺酮药物的抗菌作用靶标，同时也是抗肿瘤药物的重要作用靶点[4]。基于此，对前期α,β-不饱和酮修饰的杂环等排体进行结构简化，仅用其中的芳苄叉基作为C-3羧基等排体，与氟喹诺酮C-4羰基构建新的α,β-不饱和酮结构，进而设计合成了C-3芳苄叉基氟喹诺酮不饱和酮类目标化合物（3a～3i），进一步扩展了氟喹诺酮类的结构修饰途径。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

WK-1B数字熔点仪，上海申光仪器有限公司；AM-400型核磁共振仪，瑞士Bruker公司；Esquire LC型质谱仪，德国Bruker公司；PE2400-Ⅱ元素分析仪，美国PE公司；RAD-680型酶标仪，美国Bio-Rad公司。

培氟沙星（1），河南康泰医药有限公司；人肝癌细胞株SMMC-7721、人胰腺癌细胞株Capan-1和人白血病细胞株HL60，中科院上海细胞生物研究所。

1.2 合成路线

目标化合物3a～3i的合成见图1。培氟沙星（1）用硼氢化钾在甲醇中经2,3-双键的还原后脱C-3羧基生成2,3-二氢-喹啉-4(1H)-酮（2），接着与苯甲醛或取代苯甲醛发生羟醛缩合反应生成相应的C-3芳苄叉基氟喹诺酮不饱和酮化合物（3a～3i）。图1中，化合物3a～3i结构式中的Ar分别为H（a）、4-CH3-C6H4（b）、3-CH3-C6H4（c）、4-CH3O-C6H4（d）、2-CH3O-C6H4（e）、3,4-(OCH2O)-C6H3（f）、3,4-(OCH3)2-C6H3（g）、3,4,5-(OCH3)3-C6H2（h） 以及 4-F-C6H4（i）。

1.3 化合物2的合成

培氟沙星1（20.0 g，60.0 mmol）悬浮于无水甲醇 500 mL 中，常温搅拌下慢慢加入硼氢化钾粉末（8.1 g，150.0 mmol），待物料溶解后水浴加热至回流，搅拌反应2 h。减压蒸除溶剂，加入饱和食盐水500 mL，充分振荡至黏稠物完全分散，转入烧杯中放置固化。过滤，水洗至中性，干燥。粗品悬浮于蒸馏水200 mL中，慢慢滴加浓盐酸至粗品溶解，加入活性炭2.0 g，搅拌脱色1 h。滤液用浓氨水碱化至pH≈9.0，放置析出固体。过滤，自然干燥。用正己烷重结晶，干燥，得11.5 g淡黄色针状结晶物2。

1.4 化学合物3a～3i的合成

中间体2（1.0 g，3.4 mmol）和新蒸的苯甲醛或新的取代苯甲醛 5.0 mmol溶于无水乙醇 25 mL和氢氧化钠（0.54 g，13.6 mmol）的醇钠溶液中，常温磁力搅拌至原料2溶解。减压蒸除溶剂，剩余物加入饱和食盐水 50 mL，用浓盐酸调pH值≈2.0，用乙酸乙酯3×30 mL 提取过量的醛。水相用浓氨水碱化至pH值≈10.0，放置析出固体。过滤，用水洗至中性，干燥。粗品用乙酸乙酯-无水乙醇混合溶剂重结晶，得淡黄色针状结晶目标化合物3a～3i。

1.5 抗肿瘤活性实验

合成的9个新目标化合物（3a～3i）、对照蒽醌类抗肿瘤药阿霉素（Doxorubicin）及母体培氟沙星 1 用DMSO配成1.0×10-2mol/L浓度的储备液，用RPMI 1640培养液稀释至所需浓度（1.0×10-7mol/L、1.0×10-6mol/L、5.0×10-6mol/L、1.0×10-5mol/L 和5.0×10-5mol/L）即为供试液。取对数生长期的人肝癌细胞 SMMC-7721、人胰腺癌细胞 Panc-1、人白血病细胞 HL60，分别以每孔6 000个细胞接种于96孔板，培养隔夜后，分别加入上述供试液。

采用MTT方法检测细胞活性，用酶标仪在570 nm波长处测OD值。细胞生长抑制率计算如式（1）所示。以药物浓度的负对数值对细胞生长抑制率作剂量-效应方程，以此计算出供试化合物对实验细胞的半数抑制浓度（IC50）。所有实验在相同的条件下重复3次。

2 结果与分析

2.1 化合物的结构表征

化合物2：收率65%，熔点132～134 ℃。1H NMR（CDCl3，400 MHz）：7.25（1H，d，J=14.0 Hz，5-H），6.15（1H，d，J=7.50 Hz，8-H），3.50～3.40（4H，m，CH3CH2和3-H），3.06（4H，t，J=7.2 Hz，2′-H），2.80（4H，t，J=7.2 Hz，3′-H），2.62～2.50（2H，m，2-H），2.23（3H，s，N-CH3），1.06（3H，J=7.0 Hz，CH3CH2）。MS，m/z：实测值292[M+H]+（计算值291.37[M]）。元素分析，C16H22FN3O，实测值（计算值），%：C 66.18（65.96）；H 7.44（7.61）；N 14.67（14.42）。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-3-苯甲叉基-2,3-二氢-喹啉-4(1H)-酮（3a）：收率 78.6%，熔 点 156～ 158 ℃。1H NMR（CDCl3，400 MHz）：8.02（1H，s，3-=CH），7.74（1H，d，J=13.6 Hz，5-H），7.36～7.00（6H，m，Ph-H和8-H），4.28（2H，q，J=7.2 Hz，CH3CH2），3.74（2H，s，2-H），3.26～3.05（8H，m，2′-H）和3′-H），2.32（3H，s，N-CH3），1.32（3H，t，J=7.0 Hz，CH3CH2）。MS，m/z：实测值380[M+H]+（计算值379.48[M]）。元素分析，C23H26FN3O，实测值（计算值），%：C 73.04（72.80）；H 6.83（6.91）；N 11.30（11.07）。

1-乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-3-(4-甲基苯甲叉基)-2,3-二氢-喹啉-4(1H)-酮（3b）收率81.4%，熔点148～150 ℃。1H NMR（CDCl3，400 MHz）：7.95（1H，s，3-=CH），7.74（1H，d，J=13.6 Hz，5-H），7.26～ 6.82（5H，m，Ph-H 和8-H），4.26（2H，q，J=7.2 Hz，CH3CH2），3.66（2H，s，2-H），3.17～2.83（8H，m，2′-H和3′-H），2.30，2.24（6H，2s，N-CH3和 Ph-CH3），1.32（3H，t，J=7.0 Hz，CH3CH2）。MS，m/z：实测值 394[M+H]+（计算值393.51[M]）。元素分析，C24H28FN3O，实测值（计算 值），%：C 73.54（73.26）；H 7.02（7.17）；N 10.84（10.68）。

乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-3-(3-甲基苯甲叉基)-2,3-二氢-喹啉-4(1H)-酮（3c）收率75.2%，熔点143～145 ℃。1H NMR（CDCl3，400 MHz）：7.97（1H，s，3-=CH），7.76（1H，d，J=13.6 Hz，5-H），7.28～ 6.87（5H，m，Ph-H 和8-H），4.28（2H，q，J=7.2 Hz，CH3CH2），3.68（2H，s，2-H），3.16～2.87（8H，m，2′-H和3′-H），2.32，2.26（6H，2s，N-CH3和 Ph-CH3），1.32（3H，t，J=7.0 Hz，CH3CH2）。MS，m/z：实测值 394[M+H]+（计算值393.51[M]）。元素分析，C24H28FN3O，实测值（计算 值），%：C 73.52（73.26）；H 7.40（7.17）；N 11.06（10.68）。

乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-3-(4-甲氧基苯甲叉基)-2,3-二氢-喹啉-4(1H)-酮（3d）收率76.2%，熔点163～165 ℃。1H NMR（CDCl3，400 MHz）：7.98（1H，s，3-=CH），7.77（1H，d，J=13.6 Hz，5-H），7.26～6.88（5H，m，Ph-H和8-H），4.28（2H，q，J=7.2 Hz，CH3CH2），3.77，3.68（5H，2s，OCH3和 2-H），3.17～ 2.86（8H，m，2′ -H和 3′ -H），2.32（3H，s，N-CH3），1.35（3H，t，J=7.0 Hz，CH3CH2）。MS，m/z：实测值：410[M+H]+（计算值409.51[M]）。元素分析，C24H28FN3O2，实测值（计算值），%：C 70.63（70.39）；H 6.76（6.89）；N 10.50（10.26）。

乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-3-(2-甲氧基苯甲叉基)-2,3-二氢-喹啉-4(1H)-酮（3e）收率65.0%，熔点136～138 ℃。1H NMR（CDCl3，400 MHz）：7.97（1H，s，3-=CH），7.75（1H，d，J=13.6 Hz，5-H），7.27～ 6.86（5H，m，Ph-H 和8-H），4.27（2H，q，J=7.2 Hz，CH3CH2），3.75，3.65（5H，2s，OCH3和2-H），3.16～2.87（8H，m，2′-H 和 3′-H），2.34（3H，s，N-CH3），1.33（3H，t，J=7.0 Hz，CH3CH2）。MS，m/z：实测值 410[M+H]+（计算值409.51[M]）。元素分析，C24H28FN3O2，实测值（计算值），%：C 70.60（70.39）；H 6.72（6.89）；N 10.53（10.26）。

乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-3-(3,4-二氧亚甲基苯甲叉基)-2,3-二氢-喹啉-4(1H)-酮（3f）收率85.7%，熔点162～164 ℃；1H NMR（CDCl3，400 MHz）：8.04（1H，s，3-=CH），7.78（1H，d，J=13.6 Hz，5-H），7.02～6.73（4H，m，Ph-H和8-H），5.94（2H，s，OCH2O），4.27（2H，q，J=7.2 Hz，CH3CH2），3.63（2H，s，2-H），3.20～3.00（8H，m，2′-H 和 3′-H），2.32（3H，s，N-CH3），1.32（3H，t，J=7.0 Hz，CH3CH2）。MS，m/z：实测值 424[M+H]+（计算值423.49[M]）。元素分析，C24H26FN3O3，实测值（计算值），%：C 68.32（68.07）；H 5.96（6.19）；N 10.15（9.92）。

乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-3-(3,4-二甲氧基苯甲叉基)-2,3-二氢-喹啉-4(1H)-酮（3g）收率74.5%，熔点152～154 ℃。1H NMR（CDCl3，400 MHz）：8.02（1H，s，3-=CH），7.72（1H，d，J=13.6 Hz，5-H），7.13～6.86（4H，m，Ph-H和8-H），4.26（2H，q，J=7.2 Hz，CH3CH2），3.76，3.70，3.64（8H，3s，2′OCH3和 2-H），3.13 ～ 2.87（8H，m，2′-H 和 3′-H），2.34（3H，s，N-CH3），1.33（3H，t，J=7.0 Hz，CH3CH2）。MS，m/z：实测值 440[M+H]+（计算值439.53[M]）。元素分析，C25H30FN3O3，实测值（计算值），%：C 68.57（68.32）；H 6.68（6.88）；N 9.82（9.56）。

乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲叉基)-2,3-二氢-喹啉-4(1H)-酮（3h）收率74.8%，熔点147～149 ℃。1H NMR（CDCl3，400 MHz）：8.00（1H，s，3-=CH），7.78（1H，d，J=13.6 Hz，5-H），7.02（1H，d，J=7.0 Hz，8-H），6.64（2H，s，Ph-H），4.30（2H，q，J=7.2 Hz，CH3CH2），3.71，3.68，3.60（11H，3s，3′OCH3和2-H），3.30～3.16（8H，m，2′-H和3′-H），2.32（3H，s，N-CH3），1.33（3H，t，J=7.0 Hz，CH3CH2）。MS，m/z：实测值 470[M+H]+（计算值469.56[M]）。元素分析，C26H32FN3O4，实测值（计算值），%：C 66.74（66.51）；H 6.72（6.87）；N 9.18（8.95）。

乙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-3-(4-氟苯甲叉基)-2,3-二氢-喹啉-4(1H)-酮（3i）收率 83.0%，熔 点 158～ 160 ℃。1H NMR（CDCl3，400 MHz）：8.06（1H，s，3-=CH），7.74（1H，d，J=13.6 Hz，5-H），7.36～7.00（5H，m，Ph-H和8-H），4.27（2H，q，J=7.2 Hz，CH3CH2），3.70（2H，s，2-H），3.24 ～ 3.05（8H，m，2′-H 和 3′-H），2.33（3H，s，N-CH3），1.32（3H，t，J=7.0 Hz，CH3CH2）。MS，m/z：实测值398[M+H]+（计算值397.47[M]）。元素分析，C23H25F2N3O，实测值（计算值），%：C 69.71（69.50）；H 6.16（6.34）；N 10.73（10.57）。

2.2 抗肿瘤活性测定

培氟沙星（1）的2,3-双键受3-位羧基和4-位羰基吸电子基的影响易被硼氢化钾释放出的氢负离子（H-）加成生成相应的2,3-二氢-喹啉-4-酮-3-羧酸，接着发生脱羧反应到中间体2,3-二氢-喹啉-4-酮（2），它与芳香醛在碱性催化下发生Claisen-Schmidt缩合反应形成C-3芳叉基而构建目标化合物氟喹诺酮C-3芳苄叉基不饱和酮（3a～3i）。

体外抗细胞增殖活性结果表明（表1），9个目标化合物对3种试验肿瘤细胞株的IC50均低于40.0 μmol/L，强于对照母体培氟沙星（100 μmol/L）的活性。与此同时，初步的构效关系表明，参与构建不饱和酮的芳苄叉基，其苯环的取代基用卤素，尤其是氟原子取代可提高其抗肿瘤活性，而较大的其他取代基取代可导致活性降低，因此，选择适当的苯环取代基仍值得关注。

表1 化合物3a～3i对SMMC-7721、Capan-1和HL60细胞的抗增殖活性 IC50（n=3）

3 结论

基于前期的研究基础和本文的工作结果表明，用芳苄叉基替代C-3羧基构建的氟喹诺酮衍生物可提高氟喹诺酮的抗肿瘤活性，表明C-3羧基用杂环或α,β-不饱和酮修饰杂环替代并非必要，而用芳苄叉基替代C-3羧基可产生类似的抗肿瘤效果，提示α,β-不饱和酮结构片段可能是一个潜在的优势药效团，这将大大扩展氟喹诺酮的结构修饰途径，为进一步抗肿瘤氟喹诺化合物分子的构建提供新思路。