不同采收月份龙脑樟叶挥发油的成分分析及含量测定

崔 露 曾庆钱 冯 锐 邓 婕 崔媛媛 李 璇

（广东省中药研究所，广东 广州 510653）

龙脑樟Cinnamomum caraphora(L.) Presl是20世纪80年代发现的樟科樟属植物樟中的一种新化学类型，是我国天然冰片（右旋龙脑）来源最主要的药用植物资源之一，解决了我国天然冰片常年依靠进口的问题。天然冰片具有开窍醒神，清热止痛的功能。2020年《中国药典》（一部）中收录含冰片中成药有170多个，天然冰片较冰片的安全性高，其中四味珍层冰硼滴眼液（天然冰片）、复方熊胆滴眼液、障翳散、夏天无滴眼液等眼部用药规定只能使用天然冰片。近几年我国对于天然冰片研发不断深入，目前天然冰片已经能够用于日化用品和药品中。随着应用领域不断拓展，我国天然冰片需求持续增长，出口量也在增长，市场潜力巨大。

汤行昊等发现9-11月是龙脑樟枝叶快速生长期，12月进入稳定期。9-12月龙脑樟生物量及挥发油得率最高，适宜龙脑樟的采收。本课题组首次研究了这四个月份龙脑樟叶挥发油的成分及相对含量的变化情况，测定了右旋龙脑、樟脑和异龙脑三个指标成分的含量。本研究首先采用水蒸气蒸馏提取了9-12月的龙脑樟叶挥发油并计算得率，再采用GC-MS气相色谱-质谱联用技术分析提取物，利用峰面积归一化法计算各成分的相对含量；最后通过GC-MS外标对照品法测定了各月份挥发油中右旋龙脑、樟脑、异龙脑的含量，为龙脑樟叶挥发油成分分析和合理采收提供实验依据。

1.材料、试剂与仪器

1.1 材料

从韶关市红梨村龙脑樟种植基地采收的9月下旬、10月下旬、11月下旬、12月下旬的龙脑樟鲜叶。

1.2 仪器与试剂

气相色谱质谱联用仪（日本岛津，GCMS-TQ8040）、万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，BSA 224S-CW）、1000μL移液枪（赛多利斯科学仪器有限公司，eppendorf）、调温电热套（上海弘懿仪器设备有限公司）、变色硅胶干燥器、圆底烧瓶、球形冷凝管、挥发油提取器、量筒、容量瓶、烧杯、锥形瓶、滴管、坩埚、微孔滤膜过滤器0.45 μm。

对照品右旋龙脑（天然冰片）( 中国食品药品检定研究院，批号： 111688-201602，纯度为≥99.6% )，异龙脑（中国食品药品检定研究院，批号： 111512-201904，纯度≥98.4%），樟脑（中国食品药品检定研究院，批号： 110747-202011，纯度为≥98.8%）；丙酮（色谱纯）、乙酸乙酯（分析纯），纯水。

2.方法

2.1 不同月份龙脑樟叶挥发油的提取

2.1.1 准备龙脑樟叶

先将龙脑樟鲜叶用清水洗净，在室温下晾干表面水分后，剁碎备用。

2.1.2 龙脑樟叶挥发油的提取

取四个月下旬的龙脑樟鲜叶，按“2.1.1”项下方法准备龙脑樟叶，每月各3份，每份100g，置于5L圆底烧瓶中，加水2L，电热套加热温度设置在100℃-110℃，蒸馏至挥发油不再增加（约2h）。本研究提取挥发油的温度在100℃-110℃条件下，因为该温度下挥发油得率较高，超过120℃会导致冰片脱氢或裂解。停止加热后，待冷却后开启提取器下端活塞，将水放出，用适量乙酸乙酯溶解挥发油并转移到坩埚中，待乙酸乙酯挥干后，再放入硅胶干燥器中干燥后称重，计算挥发油得率。挥发油得率=挥发油重量/龙脑樟叶重量*100%。

2.2 不同月份龙脑樟叶挥发油的化学成分分析

2.2.1 供试品溶液制备

每次精密称取龙脑樟挥发油提取物10mg，置于10mL量瓶中，用丙酮溶解定容，用微孔滤膜过滤，作为供试品溶液进行GC-MS分析。

2.2.2 GC-MS分析

GC条 件：InertCap WAX (30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱；初始温度60℃，保持2 min，以5℃/min升至250℃，保持5 min；进样口温度250℃；载气为氦气（纯度≥99.999%），流速1.5 mL/min；进样量1.0 μL，分流比为20:1。MS条件：EI离子源温度为230℃，电子轰击能量为70 eV，溶剂延迟4 min；质量扫描范围（m/z）33～500，采集模式为全扫描。色谱-质谱接口温度：250℃。各分离组分采用美国国家标准与技术研究院NIST 2014及NIST 2014s标准质谱图数据库进行检索与定性，采用峰面积归一化法确定挥发油组分的相对含量。

2.3 外标对照品法测定挥发油中指标成分含量

2.3.1 对照品溶液制备

精密称取右旋龙脑、樟脑、异龙脑对照品适量加丙酮制备成浓度为4.572mg/mL、1.407mg/mL、1.518mg/mL的标准储备液，分别精密吸取适量体积的右旋龙脑、樟脑、异龙脑的标准储备液后加入10mL容量瓶中，用丙酮定容制成浓度为90.54μg/ml、98.49μg/ml，1.518μg/ml的C对混合对照品溶液。

图1 对照品和供试品溶液的GC色谱。A．混合对照品溶液；B．供试品溶液。

2.3.2 供试品溶液制备

取龙脑樟叶挥发油约1mg，精密称定，置于10mL容量瓶中，用丙酮溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.3.3 指标成分含量测定

2.3.3.1 色谱条件

GC条件：InertCap WAX（30m×0.25mm×0.25μm）；初始温度60℃，保持2 min，以5℃/min升至250℃，保持5 min；进样口温度250℃；载气为氦气（纯度≥99.999%）；流速1.5 mL/min；进样量1.0 μL，分流比20:1。MS条件：EI离子源温度为230℃，电子轰击能量为70eV，溶剂延迟10min；采用离子检测（SIM）模式。色谱-质谱接口温度：250℃。

2.3.3.2 方法学考察

取“2.3.1”项下制备的混合对照品溶液，按“2.3.3.1”项下色谱条件连续进样6次，计算右旋龙脑、樟脑、异龙脑的峰面积和保留时间的RSD均＜2%，表明仪器精密度良好。取“2.3.2”项下制备的供试品溶液6份，按“2.3.3.1”项下色谱条件进行测定，计算右旋龙脑、樟脑、异龙脑的峰面积和保留时间的RSD均＜2%，表明该方法重复性良好。取“2.3.2”项下制备的供试品溶液，按“2.3.3.1”项下的色谱条件，分别于0，2，4，8，12，24h进样测定，计算右旋龙脑、樟脑、异龙脑的峰面积和保留时间的RSD均＜2%，表明供试液在24h内稳定。

2.3.3.3 校正因子f计算

取混合对照品溶液连续进样6次，测定对照品峰面积（Ai），计算校正因子，

f -校正因子；C对-对照品溶液中目标物浓度；Ai-对照品溶液每次进样的目标物峰面积；-对照品溶液多次进样的目标物峰面积平均值；n-对照品溶液进样次数。目标物指右旋龙脑、樟脑和异龙脑。

2.3.3.4 供试品含量测定

取不同月份龙脑樟叶挥发油供试品溶液，按“2.3.3.1”项下色谱条件测定峰面积，重复测定3次。计算供试品中右旋龙脑、樟脑和异龙脑的质量分数X，结果见表6。

表6 龙脑樟叶挥发油中指标成分的含量测定

X-目标物的质量分数%；A供-供试品进样的目标物峰面积；M-供试品取样量；溶解体积-丙酮定容10mL。

3.结果与分析

3.1 不同月份龙脑樟叶挥发油得率结果

根据2.1.2测定的实验结果（见表1），11月的挥发油得率最高，挥发油得率的排列顺序为11月（1.70%）＞10月（1.66%）＞9月（1.61%）＞12月（1.55%），挥发油含量从9月开始增加，11月达到最高，12月开始下降。

表1 不同月份龙脑樟叶挥发油得率

1 100 1．70 1．70 10月1．66 1．58 2 100 1．65 1．65 3 100 1．64 1．63 11月1 100 1．66 1．66 1．70 1．99 2 100 1．72 1．72 3 100 1．74 1．77 12月1 100 1．40 1．40 2 100 1．56 1．56 3 100 1．45 1．45 1．47 1．55

3.2 不同月份龙脑樟叶挥发油成分分析结果

按2.2.1方法制备不同月份挥发油的供试品溶液，在2.2.2条件下进样分析，测定结果见图2、表2-表5。10月和11月的挥发油化学成分相对较少，分别为11个和13个，9月和12月的挥发油成分均有16个。这四个月份挥发油最主要成分是右旋龙脑，峰面积占比达到80%以上，其他主要成分还有樟脑、甲酸龙脑酯、乙酸龙脑酯、桉油烯醇，这5种成分的峰面积分别占到总峰面积的96.4%、99.15%、99.29%和95.13%。10月和11月的右旋龙脑的相对峰面积占比基本相同，相对含量约达95.9%，其次是9月（91.87%），12月（83.82%）最低。12月的甲酸龙脑酯与乙酸龙脑酯峰面积占比分别为4.42%、4.42%，二者合起来高达8.84%，显著高于9月（3.02%）、10月（2.36%）和11月（2.00%）。

图2 不同月份龙脑樟叶挥发油的GC-MS色谱。A． 9月份；B． 10月份；C． 11月份；D． 12月份。

表2 9月份龙脑樟叶挥发油成分的GC-MS分析

9 17．316 C10H18O 右旋龙脑 91．87 10 17．592 C15H24 β-芹子烯 0．56 11 23．450 C15H24O 石竹烯氧化物 0．86 12 24．630 C15H24O 葎草烯环氧化物 1．27 13 24．812 C15H26O 反式-橙花叔醇 0．15 14 26．399 C15H24O 桉油烯醇 0．47 15 28．858 C15H26O 十氢二甲基甲乙烯基萘酚 0．19 16 30．574 C15H22O α-香附酮 0．19

表3 10月份龙脑樟叶挥发油成分的GC-MS分析

表4 11月份龙脑樟叶挥发油成分的GC-MS分析

表5 12月份龙脑樟叶挥发油成分的GC-MS分析

15 28．914 C15H26O 十氢二甲基甲乙烯基萘酚 0．27 16 30．639 C15H22O α-香附酮 0．13

3.3 供试品中指标成分含量的结果

根据2.3.3.4测定的实验结果，不同月份的龙脑樟叶挥发油中右旋龙脑含量顺序为11月（94.23%）＞10月（92.94%）＞12月（85.71%）＞9月（81.41%），其 中，11月的龙脑樟叶挥发油的右旋龙脑含量最高为94.23%；樟脑含量顺序为9月（0.48%）＞11月（0.32%）＞12月（0.25%）＞10月（0.24%）；异龙脑质量分数均在0.02%和0.03%左右，含量极低。

4.讨论

龙脑樟以其叶片的精油含量最高，是枝的3-5倍，因此在制备龙脑樟提取物料时，不同月份龙脑樟枝叶重量比例的差异会直接影响挥发油得率，所以本研究将龙脑樟鲜叶作为实验对象，可减少实验误差。本研究在相同条件下提取了这四个月份下旬的龙脑樟鲜叶挥发油，减少操作误差，每个月的挥发油提取率RSD均＜2%。通过分析这四个月龙脑樟叶挥发油成分的种类及相对含量的差异，发现10月和11月的化学成分数量较9月和12月的少，且右旋龙脑的相对含量最高（面积归一化法）约95.9%，说明10-11月龙脑樟生成次生代谢产物更单一，右旋龙脑的生物合成途径更强。这四个月份的主要化学成分较相似，除右旋龙脑外，樟脑、甲酸龙脑酯、乙酸龙脑酯、桉油醇的含量也相对较高。该5种成分的峰面积分别占到每月总峰面积的96.4%、99.15%、99.29%和95.13%。其中，12月的甲酸龙脑酯和乙酸龙脑酯的相对含量明显高于前3个月，分别达到4.42%、4.42%，表明该月甲酸龙脑酯和乙酸龙脑酯的生物合成量增加，可就该现象进行下一步研究。

从这四个月份下旬的龙脑樟叶挥发油得率和指标成分（右旋龙脑、樟脑、异龙脑）的含量测定结果来看，11月下旬采收的挥发油得率（1.77%）和右旋龙脑含量（94.23%）均最高，为最佳采收期；右旋龙脑含量的质量分数均＞80%，樟脑含量的质量分数均＜1%，异龙脑含量的质量分数在0.02%-0.03%之间。熊科元等采用GC-MS法也检测到3年生的龙脑樟枝叶挥发油中含少量异龙脑，峰面积占比为1.90%，因此，本研究检测到龙脑樟叶挥发油中含有极少量异龙脑的实验结果正常。