宫颈癌组织中血管内皮生长因子和Grb2协同结合蛋白2的表达与患者放射治疗敏感性及预后的相关性

刘 芳，章龙珍

(1.徐州医科大学徐州临床学院，江苏 徐州 221009；2.徐州市中心医院病理科，江苏 徐州 221009；3.徐州医科大学附属医院放射治疗科，江苏 徐州 221002)

宫颈癌是临床常见的恶性肿瘤，严重影响女性身心健康。放射治疗适用于各病理期宫颈癌患者，已广泛应用于临床，但部分患者对放射治疗的敏感性欠佳，因此，探讨放射治疗敏感性的预测指标，对制定个性化放射治疗方案、节约医疗资源及改善患者预后具有重要意义[1]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种血管通透因子，能够促进血管重建和增生，改善血管通透性。研究显示，宫颈癌患者血清中VEGF水平可反映宫颈癌的恶性程度及侵袭性[2]。Grb2协同结合蛋白2(Grb2-associated binding protein-2,Gab2)属于连接蛋白，在细胞分化、增殖、凋亡等过程中发挥重要作用。研究显示，Gab2与肺癌、乳腺癌等肿瘤的发生有关[3]。本研究旨在探讨VEGF和Gab2蛋白在宫颈癌组织中的表达及其与患者放射治疗敏感性和预后的相关性，以期为宫颈癌患者的诊断与治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2014年3月至2015年9月于徐州医科大学附属医院放射治疗科行根治性放疗的宫颈癌患者为研究对象。病例纳入标准：(1)经组织病理学检查确诊为宫颈鳞状细胞癌；(2)于放射治疗前取宫颈癌组织，采集宫颈癌组织前均未接受过化学治疗、放射治疗、免疫治疗等相关治疗；(3)符合根治性放疗指征，均行根治性放疗；(4)患者自愿参与本研究并签署知情同意书。排除标准：(1)合并严重的肝、肾功能障碍及其他恶性肿瘤；(2)有淋巴转移；(3)临床资料不全。本研究共纳入宫颈癌患者120例，年龄28～75(47.38±15.14)岁；宫颈癌国际妇产科协会分期：ⅡB期48例，ⅢA期40例，ⅢB期32例。本研究通过医院伦理委员会审核批准。

1.2 实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测宫颈癌组织中Gab2、VEGF mRNA的表达(1)总RNA提取：取宫颈癌组织，采用总RNA提取试剂盒[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司]提取总RNA，使用20 μL焦碳酸二乙酯水溶解RNA，测定浓度与纯度，取适量RNA，进行PCR，剩余RNA于-80 ℃冷藏保存。(2)反转录合成cDNA：按照反转录试剂盒(美国Thermo Scientific公司)说明书进行操作，于25 μL反应体系中加入2 μL RNA，进行焦碳酸二乙酯处理，70 ℃ 孵育5 min，42 ℃ 孵育60 min。(3)PCR扩增：于2.0 mL离心管中依次加入ddH2O(17.25 μL)、cDNA(2.00 μL)、PCR buffer(2.50 μL)、25 mmol·L-1MgCl2(1.50 μL)、脱氧核苷三磷酸(2.50 μL)、上游引物(0.50 μL)、下游引物(0.50 μL)及 Taq DNA 聚合酶(0.25 μL)。反应条件：94 ℃预变性2 min、94 ℃变性30 s、退火1 min、72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。Gab2上游引物序列为5′-GTGGGGGATCTGAATGTTTTTATG-3′，下游引物序列为5′-GCCCCAGGGTAGAATGAAACG-3′；VEGF上游引物序列为5′-AGCACGAGCTACCTCAG-3′，下游引物序列为5′-TTTAGACATGCATGCATCGGCAGGAA-3′。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参，GAPDH上游引物序列为5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物序列为5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′。(4)验证电泳：取10 μL PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，应用全自动凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)分析电泳结果，采用2-△△Ct法计算Gab2、VEGF mRNA的相对表达量；实验重复3次，取均值。

1.3 免疫组织化学法检测宫颈癌组织中VEGF和Gab2蛋白的表达取宫颈癌组织，甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，置于37 ℃恒温箱中烤片30 min，脱蜡至水，抗原修复，体积分数3%H2O2阻断内源性过氧化物酶；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)冲洗3次，每次5 min；滴加体积分数4 %羊血清封闭30 min；加入一抗[VEGF兔抗人多克隆抗体(福州迈新生物技术有限公司)、Gab2兔抗人单克隆抗体(中山市澳泉医疗科技有限公司)，抗体滴度为1200]，4 ℃过夜；PBS冲洗3次，每次5 min；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(上海碧云天生物技术有限公司，抗体滴度为1250)，37 ℃ 60 min；PBS冲洗3次，每次5 min；二氨基联苯胺显色，苏木精复染，自来水冲洗10 min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。结果判定：VEGF和Gab2蛋白主要表达于细胞膜和细胞质，呈黄色、棕黄色、棕褐色。高倍镜下(×200)每张切片随机选取10个视野，采用半定量方法进行结果判断，根据阳性细胞染色强度和阳性细胞所占百分比进行评分。阳性细胞染色强度评分：未着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；阳性细胞所占百分比评分：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。以阳性细胞染色强度评分与阳性细胞所占百分比评分的乘积为最终综合评分，综合评分≥5判定为阳性，<5分判定为阴性。

1.4 患者预后及放射治疗敏感性评估分别于放射治疗后3个月及5 a评估患者的近期和远期预后[4]。近期预后判定：放射治疗后3个月患者进行CT检查，原肿瘤病灶消失且无新发病灶为肿瘤消失，原肿瘤病灶持续存在和(或)出现新肿瘤病灶为肿瘤未控。远期预后判定：放射治疗后5 a，通过CT及病理学检查对放射治疗后肿瘤消失患者是否再出现肿瘤病灶进行分析，肿瘤消失为肿瘤治愈，再度出现肿瘤病灶为肿瘤复发。临床将肿瘤消失、肿瘤治愈视为放射治疗敏感，将肿瘤未控、肿瘤复发视为放射治疗抵抗。

1.5 生存状况所有患者随访5 a，统计VEGF、Gab2蛋白表达阳性和阴性患者的5 a生存率。

2 结果

2.1 不同近期疗效患者宫颈癌组织中VEGF和Gab2 mRNA相对表达量比较结果见表1。放射治疗后3个月，120例患者中，88例肿瘤消失(肿瘤消失组)，32例肿瘤未控(肿瘤未控组)。肿瘤消失组患者宫颈癌组织中VEGF和Gab2 mRNA相对表达量显著低于肿瘤未控组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 肿瘤消失组与肿瘤未控组患者宫颈癌组织中VEGF和Gab2 mRNA相对表达量比较

2.2 不同远期疗效患者宫颈癌组织中VEGF和Gab2 mRNA相对表达量比较结果见表2。放射治疗后5 a，肿瘤消失组患者中，53例肿瘤治愈(肿瘤治愈组)，35例肿瘤复发(肿瘤复发组)。肿瘤治愈组患者宫颈癌组织中VEGF和Gab2 mRNA相对表达量显著低于肿瘤复发组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 肿瘤治愈组与肿瘤复发组患者宫颈癌组织中VEGF和Gab2 mRNA相对表达量比较

2.3 宫颈癌组织中VEGF和Gab2 mRNA表达水平与放射治疗敏感性的相关性Spearman相关性分析结果显示，宫颈癌组织中VEGF和Gab2 mRNA表达水平与放射治疗敏感性呈显著负相关(r=-459、-0.720，P<0.05)。

2.4 宫颈癌组织中VEGF和Gab2蛋白表达与患者预后的关系120例患者中，VEGF蛋白表达阳性80例(66.67%)，阴性40例(33.33%)；Gab2蛋白表达阳性103例(85.83%)，阴性17例(14.17%)。VEGF蛋白表达阳性和阴性患者的5 a生存率分别为16.25%(13/80)、67.50%(27/40)，VEGF蛋白表达阳性患者的5 a生存率低于表达阴性患者，差异有统计学意义(χ2=31.519，P<0.05)。Gab2蛋白表达阳性和阴性患者的5 a生存率分别为26.21%(27/103)、76.47%(13/17)，Gab2蛋白表达阳性患者的5 a生存率低于表达阴性患者，差异有统计学意义(χ2=16.585，P<0.05)。

3 讨论

肿瘤放射治疗是一种通过放射线进行局部治疗的治疗方式，放射线主要包括α、β、γ射线和各类X射线等[5]。临床约70%的恶性肿瘤患者需要放射治疗，但不同组织器官对放射治疗的反应不同，且放射治疗的疗效受放射敏感性影响，另外，放射敏感性与肿瘤细胞的增殖周期及病理分级密切相关。研究显示，细胞增殖活跃、分化程度低的肿瘤患者放射敏感性更高[6-7]。

VEGF是一种高特异性促血管内皮细胞生长因子，具有增加血管通透性及促进血管内皮细胞迁移、细胞基质变性、血管增殖的作用[8]。VEGF与多种肿瘤的发生、发展密切相关，宫颈癌的侵袭与转移依赖于血管的生成，VEGF参与了宫颈癌肿瘤组织中新生血管的形成，在肿瘤的生长、浸润及转移的过程中发挥作用。Gab2蛋白属于连接蛋白，可被酪氨酸激酶激活而参与细胞增殖、分化、凋亡及迁移等过程，其本身无酶活性，但存在结构位点，可吸引酶分子并完成传递。有研究显示，Gab2蛋白参与卵巢癌的发生、发展、转移过程，在疾病的进展过程中发挥作用[9]。Gab2是一个重要的肿瘤相关基因，在功能上常常作为某些原癌基因的介导元件来共同影响肿瘤的发生与发展，其表达与肿瘤的侵袭、转移关系密切。本研究结果显示，放射治疗后宫颈癌组织中VEGF、Gab2 mRNA相对表达量均不同程度降低，这与以往研究相符[10-11]。在患者的近期疗效层面，肿瘤消失组患者宫颈癌组织中VEGF和Gab2 mRNA 相对表达量显著低于肿瘤未控组；在患者的远期疗效层面，肿瘤治愈组患者宫颈癌组织中VEGF和Gab2 mRNA相对表达量显著低于肿瘤复发组；且Spearman 相关性分析结果显示，宫颈癌组织中VEGF和Gab2 mRNA表达水平与放射治疗敏感性存在显著负相关；提示放射治疗的效果与VEGF、Gab2基因表达水平呈负相关，VEGF、Gab2基因表达水平越高，放射敏感性越低，出现肿瘤未控、肿瘤复发的概率越高。究其原因可能为[12-13]：(1)基因转录启动后，蛋白产物增加，蛋白产物的适应性缺氧对VEGF的表达具有调节作用，且促进新血管生成，患者抗药性、耐药性增加；(2)VEGF通过络氨酸激酶受体发挥作用，在表皮细胞促进血管生成的过程中发挥重要的调节功能，VEGF表达升高可以诱导新生血管与淋巴管形成，促进癌细胞转移、侵袭、浸润；VEGF表达病理性升高会增加血管的通透性和渗漏，阻碍血管的成熟过程，导致血管异常，周细胞覆盖不足，引起新生血管渗漏，淋巴引流功能紊乱，氧和营养物质的传递受阻，使肿瘤组织处于低氧状态，放射治疗敏感性降低，故VEGF表达水平与放射敏感性呈负相关；(3)Gab2蛋白会加速间质转化进展，上皮间质转化赋予了细胞转移及侵入的能力，可以抑制细胞凋亡，导致肿瘤细胞对放射治疗、化学治疗产生抵抗。本研究结果显示，Gab2、VEGF蛋白表达阳性患者的5 a生存率显著低于表达阴性患者，提示VEGF与Gab2蛋白表达阴性患者预后更好，VEGF与Gab2蛋白可作为宫颈癌患者预后的预测指标。这与张绪美等[14]、孙威等[15]研究结论一致。

综上所述，VEGF和Gab2基因在宫颈癌组织中呈高表达，其表达水平与放射敏感性呈负相关，VEGF和Gab2蛋白表达阴性的患者预后更好，检测VEGF和Gab2蛋白表达对患者预后评估有一定的价值。