端粒重复结合蛋白1与磷酸化激酶Aurora B相互作用研究

王 冲,李玲玲,李梦亚,申晓辉,王树娟

(郑州大学第一附属医院血液内科，河南 郑州 450052)

端粒重复结合蛋白1(telomeric repeat binding factor 1，TRF1)是第1个被鉴定出来的端粒DNA结合蛋白，TRF1是经典的端粒长度负向调控因子，可通过抑制端粒酶的活性来调控端粒长度[1]。多项研究结果显示，过量表达TRF1能够促进细胞提前进入有丝分裂期，此外，TRF1能够通过调节着丝粒蛋白的功能参与细胞有丝分裂期染色体分离的调控[2-3]，且在有丝分裂期受到重要激酶周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinases 1，CDK1)的磷酸化调控[4-5]。以上研究结果提示，端粒相关蛋白有可能通过翻译后修饰参与细胞有丝分裂期染色体分离的调节。为进一步探讨TRF1在细胞有丝分裂期的翻译后修饰机制，本研究采用免疫沉淀实验结合质谱分析鉴定TRF1在有丝分裂期的磷酸化位点，并对TRF1与Aurora B在体内外的相互作用进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 试剂人宫颈癌HeLa细胞株由郑州大学血液病研究所提供；胎牛血清购自美国Hyclone公司，正常小鼠血清购自翌圣生物科技有限公司，青霉素、链霉素、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)、pcDNA3.1-myc-His、pEGST-C3、PET-18a、pEGFP-C3质粒购自美国Invitrogen公司，胰蛋白酶购自华美生物工程有限公司，鼠抗绿色荧光蛋白(grean fluorescent protein,GFP)单克隆抗体9B11、鼠抗谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase,GST)单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司，罗丹明偶联羊抗鼠IgG抗体(二抗)购自美国Jackson Immunoresearch公司，限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ、T4 DNA连接酶、pyrobest酶及相关缓冲液购自日本TaKaRa公司，GST蛋白纯化树脂购自日本Qiagen公司，Ni-NTA蛋白纯化树脂试剂盒购自美国Merck Millipore公司。

1.2 质粒构建通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增TRF1片段，经限制性内切酶EcoRⅠ及SalⅠ双酶切后，以T4 DNA连接酶插入pcDNA3.1-myc-His、pEGST-C3质粒载体，构建带有myc-His标记的TRF1真核表达质粒和带有GST标记的TRF1原核表达质粒；通过PCR扩增Aurora B片段，经过EcoRⅠ及SalⅠ双酶切后，以T4 DNA连接酶插入PET-18a、pEGFP-C3质粒，构建His-Aurora B原核表达质粒、GFP-Aurora B真核表达质粒。

1.3 重组载体转染细胞将人宫颈癌Hela细胞用胰蛋白酶消化并接种于6孔板，每孔5×105个细胞，细胞生长至80%融合度时弃去培养皿中的培养液，用预热的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)轻轻洗涤1遍，然后加入4 mL新鲜培养液，放回培养箱中培养，同时取myc-His-TRF1真核表达质粒及其空白对照转染Hela细胞，4 h后弃去培养皿中的培养液，用预热的PBS轻轻洗涤1遍，然后加入15 mL新鲜培养液，继续培养24 h后收集细胞用于后续实验。转染方法参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书及本课题组前期研究[6]。

1.4 8 mol·L-1尿素变性蛋白提取及质谱分析将pcDNA3.1-myc-His-TRF1真核表达质粒转染HeLa细胞，24 h后收集细胞，加入8 mol·L-1尿素裂解，裂解产物加入Ni-NTA树脂后，按照Ni-NTA树脂说明书操作，沉淀复合物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离后，经考马斯亮蓝R-250染色，切除凝胶行质谱鉴定。

1.5 免疫印迹法检测免疫共沉淀情况免疫沉淀：收集转染质粒后的细胞，用4 ℃ PBS洗涤，加入0.5 mL 4 ℃放射免疫沉淀缓冲液(radio-immunoprecipitation assay buffer，RIPA)裂解。4 ℃下12 000×g离心30 min后取上清，将上清转移至新离心管中，将细胞裂解液与正常小鼠血清及蛋白A和蛋白G琼脂凝胶珠共旋转。4 ℃下12 000×g离心30 min后取上清，将上清转移至新离心管，取出少量上清(约为离心产物总体积的5%)作为内参保存，在离心管中加入1 μg FLAG标签抗体或GFP标签抗生，4 ℃旋转过夜以捕获目的蛋白。免疫印迹：蛋白裂解物及免疫沉淀复合物用上样缓冲液加热变性，经SDS-PAGE分离后，转移至硝酸纤维素膜上，加入二抗孵育12 h后，用化学发光底物压片显影。

1.6 GST融合蛋白纯化及体外沉降实验参照谷胱甘肽S转移酶结合蛋白纯化说明书进行操作。纯化获取的重组蛋白质4 ℃保存。体外沉降实验操作步骤详见本课题组前期研究[7]。细胞裂解液经RIPA缓冲液预清除后，与谷胱甘肽琼脂糖珠对照和相应的谷胱甘肽琼脂糖珠融合蛋白共同孵育，随后行SDS-PAGE分离产物，行考马斯亮蓝染色或免疫印迹分析。

2 结果

2.1 myc-His-TRF1真核表达质粒的构建构建所得产物质粒经过双酶切后通过琼脂糖凝胶电泳验证，成功构建了含TRF1全长片段的真核表达质粒(图1)，经测序证实序列无误。

1：DNA marker；2：EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切后的pcDNA3.1-myc-His-TRF1质粒；3：空白对照。

2.2 8 mol·L-1尿素变性Ni-NTA沉淀结果结果见图2和图3。所得沉降产物切除后行质谱分析，鉴定出5个新的磷酸化位点，其中第296位丝氨酸和第417位丝氨酸2个位点符合Aurora B激酶磷酸化修饰肽段结构，表明这2个位点可能是潜在的Aurora B激酶磷酸化位点。

A:免疫沉淀产物经SDS变性分离结果;B:细胞裂解液及免疫沉淀产物蛋白质印迹结果;1：蛋白质marker；2：pcDNA3.1-myc-His-TRF1转染HeLa细胞裂解液；3：细胞裂解液Ni-NTA沉淀产物。

图3 5个新的TRF1的磷酸化位点及Aurora B磷酸化修饰肽段结构示意图

2.3 Aurora B与TRF1免疫共沉淀结果结果见图4。Flag-TRF1能够与GFP-Aurora B野生型及其激酶活性缺失体GFP-Aurora B KD相结合，形成复合物，而空GFP蛋白则不能与Flag-TRF1形成复合物。

A:细胞裂解液及免疫共沉淀产物的GFP免疫印迹结果；B:细胞裂解液及免疫共沉淀产物的FLAG免疫印迹结果。

2.4 Aurora B与TRF1体外沉降实验结果结果见图5。GST-TRF1能够与His-Aurora B在体外相结合，形成复合物，而空GST蛋白不能与His-Aurora B形成复合物。

A:细胞裂解液及免疫共沉淀产物的GFP免疫印迹结果；B:细胞裂解液及免疫共沉淀产物的FLAG免疫印迹结果。

3 讨论

端粒是存在于真核细胞染色体末端由DNA重复序列和蛋白质形成的复合结构，起到保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期的作用。TRF1是被鉴定出的第1个人端粒双链结合蛋白。TRF1是端粒长度的负向调控因子，TRF1的功能缺失可导致端粒长度异常增加[7]。此外，TRF1蛋白在细胞有丝分裂期能够与多种激酶蛋白如CDK1、Aurora A、Plk1等相互结合[8-9]。以上研究表明，TRF1及其相互作用蛋白可能在细胞周期的调控中起到重要作用。本课题组前期研究表明，TRF1能够与多种参与细胞有丝分裂时期调控的蛋白质相互作用，但其作用机制目前仍不完全清楚[6]。因此，进一步研究TRF1的翻译后修饰调控机制，有可能为细胞有丝分裂调控的生物学功能研究提供新的实验依据。

本研究中，采用8 mol·L-1尿素变性结合蛋白质质谱分析，鉴定出5个新的TRF1的磷酸化位点，第296位丝氨酸和第417位丝氨酸有可能是Aurora B的磷酸化位点，进一步研究发现，有丝分裂期重要激酶Aurora B能够与TRF1在体内形成复合物。Aurora B是有丝分裂期重要的磷酸化激酶，在调控细胞有丝分裂进程中发挥重要功能；此外，Aurora B在多种恶性肿瘤中高表达，且在p53以及核因子-κB等重要的细胞信号转导通路中也起到调控作用[10-11]。本研究首次发现，端粒结合蛋白TRF1能够与激酶相关蛋白Aurora B在体内相互结合，这为进一步鉴定TRF1在细胞有丝分裂期的生物学功能研究提供了新的研究线索和实验证据。

综上所述，本研究鉴定出TRF1新的磷酸化修饰位点；通过体内免疫沉淀实验和体外沉降实验证实TRF1能够与Aurora B在体内外相互结合。本研究结果进一步验证了TRF1有可能在细胞有丝分裂期被多种磷酸化激酶修饰，而磷酸化修饰可能是TRF1参与细胞有丝分裂期染色体分离调节的重要机制。本研究为进一步探讨端粒相关蛋白的生物学功能提供了新的实验依据。