化学遗传学技术在行为神经科学中应用的研究进展*

王一卓 汤家明 蔚洪恩，

（1 山西医科大学第五临床医学院神经内科，太原 030012；2 山西中医药大学第三临床学院，太原 030024；3 脑疾病防治山西省重点实验室，太原 030012）

近年来，现代行为神经科学领域出现的突破性技术已经成为行为神经科学研究中非常重要的实验技术工具。随着化学遗传学技术及光遗传学技术的引入、应用与完善，高解剖精度的监测和干预神经调节过程成为可能，研究行为和认知等复杂问题发生机制的思路也变得更加清晰[1]。化学遗传学技术的核心是特定药物激活特定人工设计的受体（designer receptors exclusively activated by designer drugs，DREADDs），从而对细胞群和神经环路的活性进行可逆性远程控制[2-3]。与光遗传学相比，不依赖导入光纤控制激光的非侵袭性的优势，使得DREADDs技术在临床疾病治疗中更具有前景[4]。本综述通过梳理国内外关于DREADDs技术在行为神经科学实际应用的最新进展，在揭示疾病复杂性的同时，分析总结了这一技术在解析复杂行为神经环路的优势。

1 DREADDs技术的使用

通过注射药物激活化学遗传学受体来选择性调节神经元的活动，该受体要成为有效的行为神经科学工具，必须对配体有高度亲和力，且相应配体对其它内源性受体没有药理作用[5]。

1.1 早期化学遗传学受体

G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）是已知最大的一类细胞表面受体，专门对合成小分子配体（例如气味剂、光子、生物胺、脂类、肽激素等）而非天然配体产生反应，是当代DREADDs技术的前沿。Strader等[6]通过取代单个氨基酸残基，使β-肾上腺素能受体发生突变，形成GPCR，由含有儿茶酚胺的酯类和酮类化合物激活后，改变内源性受体结合的特异性。随后Coward等[7]基于κ阿片受体开发出2个衍生物，分别为Ro1和Ro2，并将这些受体称为RASSLs（仅由合成配体激活的受体）。这2种受体的优势是降低了与许多内源性配体的结合亲和力和信号转导，同时维持了对合成小分子激动剂的结合能力，但RASSLs的合成配体通常对天然受体也具有高亲和力，因而限制了它们在体内的适用性。

1.2 定向分子进化

Armbruster等[2]利用定向分子进化技术，对酵母的人毒蕈碱型乙酰胆碱受体多轮随机诱变后，衍生出2种DREADDs：激活神经元放电的hM3Dq和抑制神经元放电hM4Di，这些DREADDs对内源性配体乙酰胆碱几乎没有亲和力，但可以被生物惰性配体氯氮平的氮氧化物（clozapinen-oxide，CNO）高选择性地激活。尤为重要的是，CNO对所有中枢神经系统靶点缺乏亲和力[2，8]，同时对乙酰胆碱受体具有高亲和性、稳定的药代动力学、良好的血脑屏障穿透性等特性[9]。因此，该DREADDs为最小侵入性远程修饰神经元活性的行为神经科学研究提供平台。

1.3 受体的类型

目前已研发出基于人类毒蕈碱的不同DREADDs可以双向调控神经元活性[2-3]，其主要的3种信号途径分别是Gq（hM3Dq）、Gi（hM4Di）和Gs（rM3Ds）。Gq通过刺激磷脂酶C，使细胞内的钙离子大量释放引起细胞兴奋性增高，神经元的放电增加[10]；Gi通过抑制腺苷酸环化酶的产生，引起细胞超极化，减少神经元的放电[11]；Gs通过刺激腺苷酸环化酶的信号通路，引起细胞兴奋性增高[10]，但Gs信号通路能在一些细胞中表现出一定的活性，限制了该受体的使用，故该类药物使用较少。表达DREADDs的神经元电生理记录显示，腹腔注射CNO后5～10 min开始初步影响神经元活动，30 min后达到峰值，并在随后的2 h内下降[12]。虽然CNO的血浆水平迅速下降，但行为影响可持续9 h[3]。该时效特点可能与啮齿类动物体内给药后CNO转化为氯氮平有关[13-14]。同时研究证明，透过血脑屏障的为氯氮平，而不是CNO，并且氯氮平激活DREADDs的亲和力及效力高于CNO[14]。然而，人类毒蕈碱的DREADDs中兴奋性受体和抑制性受体均为同一配体激活，因此在同一动物体内选择性双向调控神经元活性的研究应用中受到了限制。

近年来，通过开发一种由配体salvinorin B（SalB）激活的κ阿片受体来源（κ-opioid-derived）（KORD）来解决这一局限性[15]。SalB与CNO相比作用更快，全身给药数分钟后影响神经元活动，并持续1 h。SalB在神经元中激活病毒表达的KORD可显著减弱神经元活性并引起行为的改变。因此在同一神经元群体中同时表达hM3Dq和KORD的表达是可能的，故可以达到双重调控目的。Marchant等[16]研究已经证明，SalB完全抑制了在中脑腹侧被盖区/黑质表达KORD的多巴胺神经元的兴奋性，减少了运动行为（图1）。

图1 化学遗传学受体

2 DREADDs技术在行为神经科学研究的应用

DREADDs技术与光遗传学技术两者的用途均是选择性激活或抑制某一目标神经元的活动，但两者在受体被激活的途径上又存在差异。DREADDs技术在行为神经科学研究领域的应用有如下优势：①DREADDs技术不需要植入光纤，可对脑组织的损害降至最低，同时腹腔注射设计配体后，可逆性激活或抑制转染神经元，从而控制多个大脑区域；②DREADDs技术具有可重复性特征，改善了传统方法中多次脑立体定位注射药物对目标脑区产生损伤的不足，适用于在数天内反复且短暂操纵大脑区域的研究；③相比光遗传学技术对装置的依赖，DREADDs技术经济且高效，使用的CNO对配体具有高度亲和性，且其通过口服或腹腔注射等给药途径使得DREADDs技术更加简便可行；④DREADDs技术仅干预神经元群体从而实现高效的调控，具有相对无创、选择性、可逆性和副作用少的优点，更有利于行为障碍疾病的治疗[1]。

近年来应用DREADDs技术进行行为研究的增多，推进了人们对于各种行为的全脑神经网络和功能连接的理解。最近DREADDs技术应用的模型已经从啮齿动物扩展到非人灵长类动物，Eldridge等[17]为了研究眶额叶皮质（orbitofrontal cortex， OFC）与嗅皮质（rhinal cortex， Rh）之间的相互作用是否影响奖励行为，通过DREADDs技术可逆性中断OFCRh区域之间的关联，从而证明OFC-Rh区域是猴产生刺激-奖励关联行为的必要条件。在本综述中，笔者总结了DREADDs技术在高级认知功能和情感行为研究中的应用，包括重复刻板行为、抑郁症样行为、奖赏效应和联想学习行为。

2.1 重复刻板行为

孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）是一种早期出现的社交沟通障碍和重复刻板的感觉-运动行为的神经发育障碍性疾病[18]。在多种动物模型神经发育障碍中，重复刻板行为是ASD的一大核心临床症状，包括自我修饰、跳跃、盘旋和掩埋大理石等。多巴胺（dopamine，DA）是一种重要的神经递质，该递质可调节运动、奖励动机和内分泌功能[19]。经典的行为药理学表明，多巴胺活性与重复刻板行为密切相关[20]。由于DA系统的复杂性和异质性，目前对DA功能仍知之甚少，因此可运用DREADDs技术解析DA调节神经环路的分子和细胞机制，进而揭示重复刻板行为的中枢神经系统的病理生理机制。

多个假说提出，腹侧被盖区与黑质中的多巴胺神经元参与调控ASD的行为改变，通过在整个大脑中形成广泛的神经元连接，调节大量的突触后神经元进而影响行为[21]。其中黑质神经元投射到背侧纹状体，形成黑质纹状体环路（nigrostriatal system，NS）。有大量研究表明NS控制着运动的失活，并参与ASD小鼠重复刻板行为[22]。Wang等[23]通过构建Shank3B-KO小鼠自闭症模型，研究了Shank3BKO小鼠纹状体中D1直接途径和D2间接途径中型多棘神经元的数量改变与重复刻板行为之间的关系（图2），运用DREADDs技术予以hM3Dq序列病毒激活背侧纹状体D2受体后，显著减少了自我理毛行为，同时增强D1受体活性不影响自我理毛行为。因此Wang等[23]认为Shank3B-KO小鼠通过增强D2间接途径中型多棘神经元活性，调节背侧纹状体神经环路的失衡，进而改善重复刻板行为。同时Lee等[24]运用光遗传学技术证明正常小鼠过度激活背侧纹状体D1多巴胺受体或基因敲除D2多巴胺受体，均会导致重复刻板行为明显增多。

图2 重复刻板行为相关的基底神经节神经环路

因此大量的研究证明，重复刻板行为可能与多巴胺信号通路改变引起背侧纹状体神经环路失衡有关，DREADDs技术为进一步研究重复刻板行为的神经机制奠定基础。

2.2 抑郁症样行为

重度抑郁症（major depressive disorder，MDD）是一种精神疾病，核心症状包括情绪低落、冷漠增加和普遍丧失兴趣，为很多家庭带来了严重的负担[25]。近年来，重度抑郁症的发病率和抗抑郁药物的种类不断增加，但目前MDD药物的疗效仍存在局限性，因此提高对抑郁症相关神经环路的认识，可能会促进新的抗抑郁药物的开发，并在未来的研究中发挥重要作用。

前额叶皮质是情绪处理加工调节的关键脑区，研究表明MDD患者的前额叶皮质血流动力学反应异常[26]。Mayberg等[27]以功能性神经影像学成像平台为基础，发现了一种靶向神经调节策略，即深部脑刺激，有力证明了抑郁症与内侧前额叶皮质（medial prefrontal cortex，mPFC）的功能下降有关；此外，Hamani等[28]对mPFC脑深部刺激产生抗抑郁反应，再次表明mPFC与抑郁症的相关性。在啮齿类动物中，DREADDs技术调控mPFC脑区神经元活动以及相关神经环路都影响抑郁症行为[29]。研究报道mPFC中小清蛋白（parvalbumin， PV）中间神经元在习得性无助行为中具有引起应激反应的作用。为了确定PV-Cre小鼠中PV中间神经元活性的降低是否导致习得性无助行为的出现，通过表达hM4Di选择性抑制PV中间神经元的活性，促进无助感的产生，间接揭示了PV中间神经元在应激过程中促进行为恢复[30]。

同时，在MDD的临床前模型中，慢性抗抑郁药物治疗可以防止海马体积缩小、结构异常以及减少海马齿状回（dentate gyrus，DG）颗粒神经元的产生[31-32]。最近，Anacker等[33]证实，直接抑制DG中新生颗粒神经元的活性可以增强对慢性应激的抗压能力，但仍缺乏抗抑郁作用与DG新生颗粒神经元活动相关的直接证据。为了明确颗粒神经元增加与行为改变之间的关系，有研究表明在转基因小鼠中使用DREADDs技术选择性地操纵DG新生颗粒神经元的活性，产生抑郁和类似焦虑的行为，证明了DG新生颗粒神经元与抗抑郁作用的直接关系[34]，表明DG新生颗粒神经元可能是抑郁症治疗的潜在靶点。

2.3 奖赏反应

奖赏反应对刺激的驱动在很多精神疾病中表现为异常[35]，如该刺激驱动被放大后成为强迫性暴饮暴食[36]、酗酒[37]或吸毒[38]的诱因，若该驱动减弱会引起压力、焦虑和抑郁[39]。伏隔核（nucleus accumben， NAc）作为中脑边缘奖赏系统的中心部分，整合了多种兴奋性和抑制性刺激信号输入，如mPFC、杏仁核、海马及腹侧被盖区。NAc代表了一个完整的中枢，与奖赏反应对刺激驱动行为有关，但一直以来对NAc的主要神经调节剂乙酰胆碱的功能知之甚少。Chen等[40]关注了NAc中的胆碱能中间神经元（cholinergic interneurons， Chls），使用DREADDs技术选择性激活NAc中Chls活性，在确保Chls高比例表达DREADDs的基础上，通过CNO慢性激活逆转了社交回避等行为，表明Chls在控制奖赏反应和社交方面发挥着核心作用；与此同时，Collins等[41]通过DREADDs技术证明NAc中Chls对调控动机行为具有重要作用，因此该神经元可作为许多精神疾病，如成瘾、抑郁等的潜在治疗靶点。

2.4 联想学习行为

恐惧反射是联想学习的一种形式，也称经典条件反射。目前已知的恐惧反射相关大脑区域包括杏仁核[42]、前额叶皮质[43]和导水管周围灰质[44]。目前背内侧前额叶皮层（dorsomedial prefrontal cortex，dmPFC）与恐惧反射相关的研究仅仅是神经成像和电生理数据，很少有因果证据表明dmPFC是恐惧反射神经环路的组成部分。Yau等[45]通过DREADDs技术研究了恐惧反射的神经环路，在未出现恐惧预测错误和学习的条件下，向表达hM3Dq的dmPFC动物注射CNO可以恢复恐惧预测错误和学习等能力，从而证明了dmPFC神经元的兴奋不仅有助于恐惧反射形成，在恐惧预测错误中也扮演着重要角色，随之出现学习和行为的优化。

Frontera等[44]报道小脑顶核（fastigial nucleus， FN）向腹外侧导水管周围灰质（ventrolateral periaqueductal grey，vlPAG）传递谷氨酸兴奋性神经递质控制恐惧反射的形成。首先在FN中注入Cre依赖的腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV），同时在vlPAG中注入Cre依赖的逆行犬腺状病毒（canine adenovirus 2，CAV2），运用巴普洛夫经典条件反射实验，条件刺激（conditioned stimulus，CS）与非条件刺激（unconditioned stimulus，US）多次结合，使其CS-US之间形成了巩固的联系，证明化学遗传激活或抑制FN-vlPAG环路对空白条件下小鼠的静止状态没有影响；然后通过用CNO激活或抑制表达DREADD的FN-vlPAG投射神经元，在恐惧条件反射训练中，该通路的激活降低了恐惧记忆的形成强度，而抑制该通路则增加了恐惧记忆的形成强度；最终表明FN-vlPAG环路双向控制恐惧记忆的形成强度。

综上所述，DREADDs技术在体内操纵特定的细胞亚群，提高空间和时间分辨率，同时其在解析神经环路方面提供了独特的优势，允许有针对性、慢性抑制或激活神经元活性，是探究特定行为相关脑区的理想方法。但DREADDs技术仍存在特异性较低以及实际应用到人体中出现病毒的转染效率低和可行性低等不足。

近年来，通过局部注射带有Cre重组酶的特异性病毒载体达到提高病毒特异性的目的[46-47]，这种细胞类型的特异性可以精准地操纵其解剖投射的神经元，使得对复杂行为能有更精确理解，并可以消除相似神经元在目标区域调节其他行为引起的功能异质性，但其应用至临床治疗还需要长期观察。总体而言， DREADDs技术的不断成熟和发展、行为干预治疗的更大进展将允许通过结合DREADDs技术进行脑刺激，为疾病的临床治疗提供新思路和新方案。