五倍子酸对D-半乳糖致衰老小鼠胸腺线粒体功能的影响*

苏 晴 杨书平 李明欣 刘 莉 柴玉荣

（郑州大学基础医学院组织学与胚胎学系，郑州 450001）

胸腺是T淋巴细胞发育和产生免疫耐受的主要淋巴器官[1]。胸腺衰老与免疫衰老密切相关，与伴随的许多慢性疾病的发展有关，例如动脉粥样硬化、高血压和2型糖尿病等[2]。研究表明，胸腺衰老和功能失调可能是严重的COVID-19疾病的一个诱发因素[3]。线粒体是高度动态的细胞器，可根据细胞代谢需求维持融合和分裂的平衡，即“线粒体动力学”，从而维持其正常的形态、分布和功能。线粒体的形态适应对衰老、细胞周期、凋亡等至关重要[4-6]。在衰老和与年龄相关的疾病中可见异常的线粒体结构，表明线粒体动力学随着细胞的衰老而受到损害[7]。五倍子酸 （3，4，5-三羟基苯甲酸，gallic acid， GA） 也称为没食子酸，是一种天然多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎症和抗肿瘤等多种作用，对D-半乳糖诱导胸腺加速衰老具有一定的保护作用[8]。五倍子酸是否通过影响线粒体功能，改善衰老胸腺的组织结构，尚未清楚。本研究旨在从线粒体膜电位和线粒体动力学角度探索五倍子酸对胸腺线粒体功能的影响及机制。

1 材料和方法

1.1 动物分组和主要试剂

30只2月龄昆明小鼠购自郑州大学实验动物中心，体质量为29～37 g，清洁级环境饲养。动物实验通过郑州大学动物实验伦理委员会的批准。

30只昆明小鼠随机分为对照组、D-半乳糖致衰老模型组（D-半乳糖组）、五倍子酸治疗组（五倍子酸组），每组5只，雌雄各半。对照组腹腔注射0.9%生理盐水，第3～8周同时灌胃给予五倍子酸的溶剂羧甲基纤维素钠（CMC-Na）；D-半乳糖组腹腔注射120 mg/kg D-半乳糖[9]， 3～8周同时灌胃给予CMC-Na；五倍子酸组腹腔注射120 mg/kg D-半乳糖， 3～8周同时灌胃给予250 mg/kg 五倍子酸[8]。每天定时给药，8周后处死动物，取材备用。

主要试剂如下：Mfn1和Mfn2抗体（上海艾博抗有限公司）；动力相关蛋白1（Drp1）抗体（武汉三鹰）；RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂（上海碧云天）；凝胶试剂盒（北京鼎国）；五倍子酸、线粒体膜电位检测试剂盒（北京索莱宝）；免疫组织化学二抗显色试剂盒（北京中杉金桥）。

1.2 H-E染色和免疫组织化学显色

胸腺组织一叶，4%多聚甲醛固定24 h，流水冲洗，石蜡包埋，制作石蜡切片，片厚5 μm。采用H-E染色，中性树胶封片后，光学显微镜观察、拍照。

胸腺组织切片经过梯度乙醇脱蜡复水后，微波修复法进行抗原修复，PBS冲洗，滴加相应血清封闭，加一抗：兔抗Mfn2多克隆抗体（1∶50），置4℃孵育过夜，滴加生物素标记的山羊抗兔IgG于37℃恒温箱中孵育30 min，DAB显色，苏木精复染细胞核，冲洗返蓝，盐酸乙醇分色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片，光学显微镜拍照、观察阳性细胞的定位和表达。

1.3 衰老相关的β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidas，SA-β-Gal）检测

一叶胸腺组织，固定后，冰冻切片， 厚度7 μm。显色液：1 mg/mL的X-Gal，-20℃保存备用。母液：40 mmol/L的柠檬酸/磷酸钠盐缓冲液（pH6.0），5 mmol/L亚铁氰化钾冲液，5 mmol/L铁氰化钾冲液，150 mmol/L氯化钠，2 mmol/L氯化镁，4℃避光保存。组织切片冷丙酮固定20 min，PBS冲洗，避光滴加显色液，阴性对照组滴加不含x-gal的母液，37℃孵育3～5 h，PBS 冲洗，中性红复染细胞核，封片，显微镜观察、拍照。

1.4 线粒体膜电位检测

胸腺组织研磨，400目网筛分离胸腺细胞。线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）按照说明书步骤进行，配置JC-1染色工作液，设置阳性对照，胸腺细胞重悬于细胞培养液，加入0.5 mL JC-1染色工作液，37℃孵育20 min，4℃离心5 min，弃上清，JC-1染色缓冲液（1×）重悬后，荧光酶标仪检测。JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物，产生红色荧光；当线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，产生绿色荧光。红绿荧光的相对比例可以衡量线粒体去极化状态，JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变，用于检测细胞膜电位的变化。

1.5 免疫印迹检测

胸腺组织中加入RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂后进行研磨提取蛋白质，4℃离心，取上清液，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量，上样缓冲液，100℃水浴锅加热5 min使蛋白质变性。SDSPAGE蛋白电泳，并将蛋白转移到PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭非特异性抗原，分别孵育一抗Mfn1（1∶1 000）、Mfn2（1∶5 000）、Drp1（1∶3 000）、β-actin（1∶2 000），4℃过夜，TBST洗膜。加辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000），室温孵育2 h，加ECL显色剂曝光成像。

1.6 图像分析和统计学处理

在高倍显微镜下观察免疫组织化学和SA-β-Gal染色的切片，每张切片随机选取5个不同视野采集图像，观察阳性颗粒在细胞中的分布，统计抗体阳性的细胞面积和SA-β-Gal染色的阳性区域。图像分析使用Image J软件，并用GraphPad Prism 8软件进行数据统计分析和作图。计量资料以±s表示，组间比较使用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠胸腺组织结构分析

H-E染色结果显示，D-半乳糖处理8周后，胸腺组织的皮、髓质结构较紊乱，皮质区变薄，皮、髓质比降低；而对照组和五倍子酸添加6周后的胸腺组织皮、髓质交界较为明显，且周围皮质较厚。说明五倍子酸能明显改善D-半乳糖诱导的急性衰老引起的胸腺组织结构紊乱（图1，见封二）。

图1 各组胸腺组织H-E染色，标尺=200 μm 。A：对照组； B：D-半乳糖组； C：五倍子酸组.

2.2 五倍子酸减少了胸腺组织中的衰老细胞

衰老相关的β-半乳糖苷酶能标记组织中的衰老细胞，SA-β-Gal阳性信号为分布在细胞胞质内的蓝色颗粒，阳性细胞是衰老细胞。通过SA-β-Gal染色实验（图2，见封二），结果显示，与对照组（0.561 2）的正常小鼠比较，D-半乳糖组（1.372 5）胸腺组织中衰老细胞数量明显增多（P＜0.05）；补充五倍子酸（0.479 5）后，胸腺组织中SA-β-Gal阳性的衰老细胞显著减少（P＜0.01）。本研究结果证实，D-半乳糖能有效诱导胸腺组织的细胞衰老，而五倍子酸能明显减缓胸腺组织的细胞衰老。

图2 各组胸腺组织中的衰老细胞检测 A～C：标尺=50 μm；D～F：标尺=20 μm。 A、D：对照组； B、E：D-半乳糖组； C、F：五倍子酸组.

2.3 五倍子酸增加胸腺细胞线粒体膜电位

胸腺细胞的线粒体膜电位检测结果显示，与对照组比较（红/绿=5.3），D-半乳糖组线粒体膜电位下降（红/绿=3.2）；与D-半乳糖组比较，五倍子酸组线粒体膜电位上升（红/绿=5.6），差异均有统计学意义（P＜0.05）（图3）。结果提示，五倍子酸可缓解D-半乳糖诱导的线粒体膜去极化程度，对线粒体具有保护作用。

图3 各组胸腺细胞中线粒体膜电位的变化

2.4 五倍子酸促进胸腺组织的Drp1表达

免疫印迹检测结果显示，与对照组比较，D-半乳糖组小鼠的胸腺组织中线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2表达水平无明显变化，Drp1表达水平降低；补充五倍子酸后， Drp1表达水平显著升高（P＜0.05），而Mfn1和Mfn2表达水平无明显变化（图4）。结果提示，D-半乳糖诱导的急性衰老打破了胸腺组织中线粒体融合和分裂的平衡，导致线粒体功能障碍，而五倍子酸恢复了胸腺组织中线粒体融合和分裂的平衡。

图4 各组胸腺组织中Drp1、Mfn1、Mfn2蛋白的表达

2.5 胸腺组织Mfn2的原位表达

进一步通过免疫组织化学显色验证Mfn2在组织中的原位表达，结果显示，Mfn2阳性细胞主要表达在胸腺的髓质区域。对照组（3.528 3）、D-半乳糖组（3.862 0）和五倍子酸（3.778 3）组间Mfn2的表达水平差异无统计学意义（图5，见封二）。

图5 各组胸腺组织中Mfn2的表达。A～C：标尺=50 μm；D～F：标尺=20 μm。A、D：对照组； B、E：D-半乳糖组； C、F：五倍子酸组.

3 讨论

胸腺是重要的中枢免疫器官。随着年龄增长，胸腺结构和功能发生衰退，表现在胸腺组织结构紊乱，T淋巴细胞输出减少，导致机体免疫能力下降以及感染增加等慢性疾病的发生[10-11]。五倍子酸是一种多酚天然产物，广泛分布于水果、蔬菜、香料和茶等不同种类的植物中，具有抗氧化、抗炎等多种性能[12-13]。笔者课题组前期工作表明，五倍子酸可以延缓与年龄相关的小鼠胸腺退化[8]，但其机制需要进一步阐明。本研究建立了D-半乳糖急性致衰老的动物模型，组织学分析表明，模型组小鼠胸腺的正常组织结构被破坏，衰老细胞增多，具有胸腺退化表型；并从线粒体膜电位和线粒体动力学角度探索五倍子酸对胸腺结构和功能的保护作用及潜在机制。

线粒体在细胞信号转导和生物稳态中发挥重要作用，组织中线粒体功能的下降被认为是衰老的主要标志[14-15]。线粒体膜电位是衡量线粒体功能的重要指标，膜电位降低可诱导线粒体凋亡[16]。研究表明，五倍子酸对线粒体功能具有保护作用[17-18]。本研究结果显示，五倍子酸补充后，胸腺细胞的线粒体膜电位上升，提示五倍子酸也能改善胸腺组织中的线粒体功能。

为适应细胞内外环境的变化，线粒体不断进行分裂和融合。调节线粒体动力学的核心机制组成部分是动力蛋白家族，这些GTP酶决定了这些动态转变[19]。Mfn1、 Mfn2介导外膜融合，参与线粒体融合，线粒体融合不仅利于物质交换，并可能弥补其功能缺陷[20]。Drp1参与线粒体分裂，在细胞分裂期间，产生新的线粒体、受损线粒体的分离、线粒体的运输都需要线粒体分裂[21]。在生理条件下，线粒体融合和分裂以不断平衡的方式发生，形成一个动态的互连网络。本研究结果显示，D-半乳糖组Mfn1和 Mfn2表达水平无明显变化，但Drp1表达水平明显降低，线粒体融合和分裂的平衡被打破，线粒体的形态受到影响，从而导致线粒体功能障碍；与D-半乳糖组比较，五倍子酸组的Drp1表达水平上升，提示五倍子酸使线粒体融合和分裂的平衡一定程度上得以恢复。通过免疫组织化学显色也验证了Mfn2在各组之间表达相对一致，与免疫印迹结果相互佐证。

综上所述，D-半乳糖急性致衰老导致胸腺组织学结构紊乱，衰老细胞增多，线粒体膜电位下降，并且线粒体融合和分裂的平衡被打破，而五倍子酸的干预可以减少胸腺中的衰老细胞数目，一定程度上恢复胸腺的组织学结构。其机制可能与增加胸腺细胞的线粒体膜电位，增加组织细胞中线粒体分裂，维持线粒体融合和分裂的平衡有关，从而维持线粒体正常功能，对胸腺组织的衰退起到了保护作用。