miR-320b激动剂对心肌梗死大鼠心室重塑的影响*

李文杰 张 方 李秋凤 程运杰 屈肖杰

（焦作市第二人民医院，1 心内三区，2 神经内科，4 呼吸与重症医学科，焦作 454001；3 河南省中医药研究院心內科，郑州 450000）

心血管疾病是目前威胁人类健康的主要疾病之一，尤其是急性心肌梗死是导致心血管疾病患者发病率增加的重要因素[1]。吸烟、代谢综合征和高血压等是影响心肌梗死患者高发病率和高死亡率的主要危险因素[2]。目前的治疗方法包括外科手术和溶栓治疗容易诱发额外再灌注损伤，因此必须开发有效的替代方法来治疗心肌梗死。一些miRNA在心肌细胞凋亡中发挥着重要的调控作用，调控miRNA的表达可以影响心肌细胞凋亡进程，这为人类和动物心血管疾病的预测、诊断与治疗提供了新的思路[3]。研究表明，miR-320b表达在心肌梗死患者中明显降低[4]，但miR-320b对心肌梗死的具体作用机制尚不清楚。本研究通过构建心肌梗死大鼠模型，探讨miR-320b过表达对心肌梗死大鼠心室重塑过程的影响，为临床治疗心肌梗死提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

48只雄性SD大鼠购自河南省实验动物中心，6周龄，体质量（190±10）g，许可证号：SCXK（豫）2017—0001。饲养于SPF级屏障实验室。

1.2 实验试剂

Agomir-NC、miR-320b agomir购自上海吉玛制药技术有限公司； 2，3，5－三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染液（D025-1-3）、原位末端标记（Terminal deoxynucleotidyl transferase deoxyuridine triphosphate nick end labeling，TUNEL）细胞凋亡原位检测试剂盒（G002-2-2）购自南京建成生物工程研究所；白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）（ZN2272-PIU）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（ARB13318）和白细胞介素-1β（interleukin-6，IL-1β）（ARB10508）购自北京百奥莱博科技有限公司；一抗Bax（ab104156）、Bcl-2（ab194583）、caspase-3（ab13847）、cleaved caspase-3（ab2302）、cleaved caspase-9（ab2324）、caspase-9（ab52298）、GAPDH（ab9485）购自英国Abcam公司。

1.3 动物模型建立与分组

参照黎镇赐等[5]方法制作心肌梗死大鼠模型，将大鼠随机分为4组：假手术组、模型组、阴性对照组（对照组）、miR-320b过表达组。除假手术组外，其余各组采用结扎心左冠状动脉前降支（心左冠状动脉起始部位下2～5 mm处）的方法建立心肌梗死大鼠模型，术后24 h，对照组、miR-320b过表达组经尾静脉注射agomir-NC或miR-320b agomir，每日1次，连续注射3 d。

1.4 超声心动图

最后一次注射24 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，左侧卧位，采用彩色多普勒超声仪检测各组大鼠左心室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室舒张末期压（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）和左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5 RT-PCR检测miR-320b、MHC-αmRNA和MHC-β mRNA表达

超声心动图检测结束后，处死所有大鼠，开胸取出心并分成若干部分， 4%多聚甲醛溶液固定，或储存在液氮中。取部分保存在液氮中的各组大鼠心肌组织，用TRIzol法提取总RNA，使用FastKing RT试剂盒通过标准反应进行mRNA的逆转录，使用Fast qPCR Mix进行实时PCR，反应条件为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃15 s，35个循环。miR-320b相对表达水平以U6为内参，基因相对表达水平以GAPDH为内参。引物序列如下：miR-320b，正向引物：5'-GCAAAAG CTGGGTTGAGA-3'，反向引物：5'-CAGTGCGTGT CGTGGA-3'；U6，正向引物：5'-CTCGCTTCGGCA GCACA-3'，反向引物：5'-TCATCCAAATACTCC ACACGC-3'；MHC-α，正向引物：5'-AAGTCCTCCC TCAAGCTCATGGC-3'，反向引物：5'-ATTTTCCCG GTGGAGAGC-3'；MHC-β，正向引物：5'-GCTGT TATTGCAGCCATTG-3'，反向引物：5'-TTCCTGT TGCCCCAAAATG-3'；GAPDH正向引物：5'-ACAG CCTCAAGATCATCAGC-3'，反向引物：5'-GGTCA TGAGTCCTTCCACGAT-3'。以PCR仪自带软件获取Ct值，通过公式2-△△Ct计算mRNA相对表达量。

1.6 TTC染色检测心肌梗死面积

按照TTC染液说明书，将新鲜心肌组织切片置于装有TTC染液的培养皿中，37℃避光孵育30 min，用组织冲洗液将组织表面多余染色液冲洗掉，拍照并观察样本颜色变化，切片非梗死区呈玫瑰红色，梗死区组织发白，红色区与灰色区之间为未缺血区。计算梗死面积比例。

1.7 H-E染色观察心肌组织结构

将各组大鼠心肌组织置于4%多聚甲醛中固定72 h，随后将已固定的心肌组织置于20%乙二胺四乙酸中进行脱钙处理，将样品在梯度浓度的乙醇中脱水，并石蜡包埋、切片，片厚5 μm，苏木精染色10 min，伊红染色2 min，中性树胶封片。使用光学显微镜观察心肌组织病理学变化。

1.8 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡

将大鼠心肌组织切片用二甲苯浸洗2次脱蜡，每次5 min，梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70 %）各浸洗1次，每次3 min。参照TUNEL凋亡试剂盒说明书，用蛋白酶K工作液在37 ℃下封闭20 min，PBS清洗2次。在每个切片样本上加入TUNEL反应液50 μL，37 ℃闭光反应60 min。用DAPI复染10 min后荧光显微镜下观察心肌细胞凋亡情况。

1.9 免疫印迹检测心肌组织凋亡蛋白水平

取部分保存在液氮中的各组大鼠心肌组织，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白转移至PVDF膜。4 ℃下加入Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、caspase-3、cleaved caspase-9、caspase-9一抗（1∶1 000）孵育过夜，TBST清洗后加入HRP-IgG（1∶10 000），加入电化学发光显色液显色。以GAPDH为内参，Image J V1.8.0.112软件分析各组细胞目的蛋白与GAPDH比值。

1.10 ELISA检测心肌组织TNF-α、IL-1β、IL-6水平

将各组大鼠心肌组织置于含蛋白酶抑制剂的裂解液的玻璃匀浆器中匀浆，12 000 r/min离心15 min，收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.11 统计学处理

使用GraphPad Prism 5进行统计分析。实验数据用±s表示，两组间比较采用独立的t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-320b过表达上调心肌梗死大鼠miR-320b、MHC-αmRNA水平，降低MHC-β mRNA水平和心肌梗死面积

与假手术组比较，模型组大鼠miR-320b、MHC-α mRNA水平降低，MHC-β mRNA水平升高，心肌梗死面积增加（P＜0.05）；与模型组比较，miR-320b过表达组大鼠miR-320b、MHC-α mRNA水平升高，MHC-β mRNA水平降低，心肌梗死面积减小（P＜0.05）（图1）。

图1 miR-320b过表达对心肌梗死大鼠miR-320b、MHC-α、MHC-β mRNA水平和心肌梗死面积的影响

2.2 miR-320b过表达升高心肌梗死大鼠LVEF、LVFS、LVSP，降低LVEDP

与假手术组比较，模型组大鼠LVEF、LVFS、LVSP降低，LVEDP升高（P＜0.05）；与模型组比较，miR-320b过表达组大鼠LVEF、LVFS、LVSP升高，LVEDP降低（P＜0.05）（图2）。提示miR-320b过表达可明显改善心肌梗死大鼠的心功能障碍。

图2 miR-320b过表达对心肌梗死大鼠LVEF、LVFS、LVSP、LVEDP的影响

2.3 miR-320b过表达改善心肌梗死大鼠心肌组织病理损伤

假手术组大鼠心肌纤维排列规整，未见变性及炎症细胞浸润。模型组心肌纤维排列紊乱、间隙变宽，部分心肌纤维出现断裂。miR-320b过表达组大鼠心肌组织病理损伤程度明显改善，心肌纤维排列较规整，心肌纤维偶有断裂（图3）。提示miR-320b过表达可有效减轻心肌梗死大鼠的心肌损伤。

图3 miR-320b过表达对心肌梗死大鼠心肌组织病理损伤的影响。A： 假手术组；B：模型组；C：对照组；D：miR-320b过表达组.

2.4 miR-320b过表达降低心肌梗死大鼠心肌组织细胞凋亡

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与模型组比较，miR-320b 过表达组大鼠心肌组织细胞凋亡率降低（P＜0.05）（图4）。提示miR-320b过表达明显抑制心肌梗死大鼠心肌细胞的凋亡。

图4 miR-320b过表达对心肌梗死大鼠心肌组织细胞凋亡率的影响。A：假手术组；B：模型组；C：对照组；D：miR-320b过表达组；E：各组细胞凋亡率比较，*P＜0.05 vs 假手术组，#P＜0.05 vs 模型组.

2.5 miR-320b过表达降低心肌梗死大鼠Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9比值

与假手术组比较，模型组大鼠Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9比值升高（P＜0.05）；与模型组比较，miR-320b过表达组大鼠Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9比值降低（P＜0.05）（图5）。提示miR-320b过表达可有效抑制心肌梗死大鼠心肌组织中促凋亡蛋白的表达。

图5 miR-320b过表达对心肌梗死大鼠Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9比值的影响

2.6 miR-320b过表达降低心肌梗死大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平

与假手术组比较，模型组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，miR-320b过表达组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05）（图6）。提示miR-320b过表达可显著抑制心肌梗死大鼠的炎症因子水平。

图6 miR-320b过表达对心肌梗死大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响

3 讨论

心肌梗死后心室重塑与基因表达的异常改变密切相关，相关研究表明miRNA可影响心肌梗死后左心室重塑的进程，在心肌梗死和梗死后心室重塑的过程中起关键作用[6]。本研究通过RT-PCR和TTC染色实验研究发现，miR-320b过表达可升高miR-320b、MHC-α mRNA水平，降低MHC-β mRNA水平和心肌梗死面积。肌球蛋白重链是构成肌纤维的重要成分，可分为MHC-α和MHC-β，心肌梗死后心室重塑过程中心肌细胞内肌球蛋白重链表型发生变化，由MHC-α向MHC-β转化，表现为心肌细胞内MHC-α表达降低，MHC-β表达升高，心肌细胞肥大[7]。限制心肌梗死大鼠的梗死面积具有抗心肌梗死的作用[8]。Zhang等[9]研究表明miRNA-203的表达增加可改善心脏功能，减少梗死面积。任恺等[10]研究显示miR-21升高MHC-α RNA表达量，降低MHC-β RNA表达量保护心脏结构的完整性，加速心室重塑的进展。提示miR-320b过表达与心肌梗死后心室重塑有关。

本研究通过超声心动图和H-E染色显示，miR-320b过表达可升高心肌梗死大鼠LVEF、LVFS、LVSP，降低LVEDP，改善心肌组织病理损伤。LVEF、LVFS、LVSP、LVEDP是评价心功能的常用指标。心室重塑是心肌梗死的发病机制之一，而心室重塑与心肌梗死患者的病情进展及不良预后存在相关性[11]。提示miR-320b过表达可改善心肌梗死大鼠模型心功能。

本研究通过TUNEL染色和免疫印迹检测结果显示，miR-320b过表达可降低心肌梗死大鼠心肌组织细胞凋亡率和Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/caspase-3、cleaved caspase-9/caspase-9比值。减少心肌组织凋亡已经成为心肌梗死后预防心室重构、调节心功能紊乱的重要方式[12]。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2可相互作用，其形成的复合物比值的高低可判定细胞凋亡状态[13]。caspase家族处于细胞凋亡过程中的核心地位，可通过与多种蛋白因子相互作用调节细胞凋亡，其中caspase-3在凋亡级联中过度活化能够促进细胞凋亡[14]。caspase-9接收信号开始作用时能够引发凋亡，会激发caspase-3共同作用促进细胞凋亡[15]。提示miR-320b过表达可抑制心肌组织凋亡。

本研究ELISA检测结果显示，miR-320b过表达可降低心肌梗死大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平。心肌梗死症状的发生发展通常伴有心肌组织炎症，心肌损伤的严重程度与心肌组织炎症密切相关，表现为血清中炎症因子及趋化因子水平升高引起强烈的炎症反应，加重心肌缺血性损伤。调节心肌梗死后的炎性应答反应可以改善心肌梗死后心脏重塑，对心肌梗死患者心肌纤维化和心功能改善具有重要意义。彭晖[16]等研究表明IL-6、TNF-α、IL-1β等炎症因子在急性心肌梗死后心肌纤维化过程中有重要作用，上调其水平将促进胶原沉积和心肌纤维化，最终导致心室重构[17]，表明miR-320b过表达可通过抑制炎症因子的释放对心肌梗死大鼠心肌组织起保护作用。