长链非编码 RNA MCM3AP-AS1对NSCLC细胞增殖、侵袭及迁移的影响*

王 亮

郑州大学附属洛阳中心医院医学检验科，河南洛阳 471000

肺癌目前已成为我国肿瘤死因首位，多发病于男性，其主要的致病原因与吸烟、环境等因素密切相关[1-2]。肺癌根据其病理特征和治疗的方法可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)两种类型，其中NSCLC占肺癌患者的 90%左右[3]。

随着肿瘤分子生物学的发展，与肺癌相关的新型分子生物学标志物不断问世，肿瘤的诊疗方法也有了新的方向。近年来，长链非编码RNA(lncRNA)在肿瘤中的研究备受关注[4-6]。已有大量研究表明，lncRNAs 可影响许多类型肿瘤进展。lncRNA微小染色体维持蛋白3相关蛋白-反义链1(lncRNA MCM3AP-AS1)基因位于21号染色体上，在癌症的进展中发挥了重要作用。有研究表明，lncRNA MCM3AP-AS1在肝癌等肿瘤中表达上调，能促进相关癌症的恶性表型[7-10]。有研究显示，lncRNA MCM3AP-AS1在NSCLC组织中高表达[11]，但其作用机制还存在争议。本研究旨在探讨lncRNA MCM3AP-AS1对NSCLC细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1主要细胞 A549肺癌细胞株由实验室保藏。

1.2主要试剂和仪器 RPMI 1640 培养基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶购自四季青生物有限公司；CCK8试剂购自日本同仁化学研究所； Lip2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；lncRNA MCMAP-AS1和GAPDH引物由上海生工合成；lncRNA cDNA合成试剂盒和lncRNA 荧光定量检测试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；酶标仪购自Thermo公司；荧光定量PCR(Step one plus)仪器购自ABI 公司；荧光显微镜购自德国蔡司公司；离心管、培养瓶、移液管等细胞培养耗材均购自康宁公司。lncRNA MCM3AP-AS1过表达质粒和sh-MCM3AP-AS1敲低质粒及相应的阴性对照物由上海吉玛基因合成。

1.3方法

1.3.1细胞培养、分组与转染 将A549肺癌细胞培养于含10%FBS(链霉素和青霉素双抗)的RPMI1640 培养基中，置于 37 ℃、5%CO2培养箱内培养，培养至对数生长期后进行后续一系列实验。将A549肺癌细胞分为空白对照(Control)组、阴性对照(NC)组、过表达MCM3AP-AS1组和敲低sh-MCM3AP-AS1组。其中NC组利用空载质粒转染A549肺癌细胞，过表达MCM3AP-AS1组利用lncRNA MCM3AP-AS1过表达质粒转染A549肺癌细胞，sh-MCM3AP-AS1组利用sh-MCM3AP-AS1敲低质粒转染A549肺癌细胞，按照相关Lip2000转染试剂盒说明书进行操作；空白对照组不进行转染处理。 转染 48～72 h 后，收集细胞，开展后续一系列相关实验。

1.3.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测 lncRNA MCM3AP-AS1 的表达 依据在NCBI 数据库中查到lncRNA MCM3AP-AS1的序列设计相关引物。按TrIzol 试剂提取说明书提取各组细胞的总 RNA，反转录得到cDNA，以该 cDNA 为模板，根据试剂盒说明书进行qRT-PCR，每个体系设置3个重复孔，以GAPDH作为lncRNA MCM3AP-AS1的标准化内参，具体引物条件见表1。测量3次，采用 2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3CCK8细胞增殖实验 A549 肺癌细胞分别转染lncRNA MCM3AP-AS1过表达质粒、sh-MCM3AP-AS1敲低质粒及空载质粒48 h 后将细胞消化离心，重悬细胞并计数。将A549肺癌细胞用胰酶消化传代，分别取对数期生长的细胞以 6 000 个/孔接种于 96 孔板中。细胞贴壁培养后，分别在 0、24、48、72 h 加入10 μL CCK-8 试剂，37 ℃培养箱中培养 2 h 后取出，450 nm 处记录吸光度(A)值，每组3个复孔。比较4组间A值差异。

1.3.4细胞侵袭和迁移实验

1.3.4.1Transwell实验 A549肺癌细胞转染lncRNA MCM3AP-AS1过表达质粒、sh-MCM3AP-AS1敲低质粒和空载质粒 48 h 后将细胞消化离心，重悬细胞并计数。以 8×104/200 μL 加入Transwell上室。下室中加入含有10%的胎牛血清完全培养基650 μL，放入37 ℃培养箱中培养24 h，用棉棒清掉未穿入下室的细胞，甲醇固定 30 min，0.1%的结晶紫染色30 min。蒸馏水清洗晾干后，随机观察5个低倍镜视野，计数平均值，比较每组间的差异。

1.3.4.2划痕实验 将细胞密度为5×105个/mL的lncRNA MCM3AP-AS1过表达质粒、sh-MCM3AP-AS1敲低质粒、空载质粒以及对照组铺在6孔板中，转染48 h后用1 mL无菌枪头在6孔板上“一”字划痕，用PBS 将其清洗3遍以去除划下的细胞，加入无血清培养基后于37 ℃培养24 h，显微镜下观察并采集图像。

2 结 果

2.1lncRNA MCM3AP-AS1在各转染细胞中的表达情况 qRT-PCR测定不同转染组A549肺癌细胞中lncRNA MCM3AP-AS1及其内参照物的相对表达水平，结果显示：与Control组相比，NC组lncRNA MCM3AP-AS1相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；过表达MCM3AP-AS1组细胞中lncRNA MCM3AP-AS1相对表达水平为Control组的(272±1.32)倍，显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)；敲低sh-MCM3AP-AS1组肺癌细胞中lncRNA MCM3AP-AS1相对表达水平为Control组的(0.625±0.01)倍，显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2lncRNA MCM3AP-AS1对NSCLC细胞增殖的影响 CCK8细胞增殖实验测定了不同转染组中肺癌细胞的增殖水平，结果显示：24 h时，与Control组相比，NC组、过表达MCM3AP-AS1组和敲低sh-MCM3AP-AS1组肺癌细胞增殖水平差异无统计学意义(P>0.05)；48 h和72 h时，NC组肺癌细胞增殖水平差异无统计学意义(P>0.05)，过表达MCM3AP-AS1组肺癌细胞增殖水平显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)，而敲低sh-MCM3AP-AS1组肺癌细胞增殖水平显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1及表2。

图1 CCK-8细胞增殖情况

2.3lncRNA MCM3AP-AS1对NSCLC细胞侵袭、迁移的影响

表2 CCK8细胞增殖实验结果值)

图2 Transwell实验肺癌细胞侵袭情况(×200)

表3 不同时间计算的各组平均细胞数目(个)

Transwell实验测定了不同转染A549肺癌细胞组中肺癌细胞的侵袭水平，结果如图2和表3所示。24 h时，与Control组相比，NC组单位面积肺癌细胞侵袭数目差异无统计学意义(P>0.05)，过表达MCM3AP-AS1组单位面积肺癌细胞侵袭数目显著增加(P<0.05)，敲低sh-MCM3AP-AS1组单位面积肺癌细胞侵袭数目显著较少(P<0.05)。

图3 划痕实验肺癌细胞迁移情况(×50)

划痕实验检测了不同转染A549肺癌细胞组中肺癌细胞的迁移水平，结果如图3所示。24 h时，与Control组相比，NC组两侧肺癌细胞之间的距离变化不大(P>0.05)，过表达MCM3AP-AS1组两侧肺癌细胞之间的距离显著降低(P<0.05)，敲低sh-MCM3AP-AS1组两侧肺癌细胞之间的距离显著增加(P<0.05)。

3 讨 论

近年来的研究中发现lncRNA MCM3AP-AS1在肿瘤的发生、发展中已成为研究热点。研究表明，lncRNA MCM3AP-AS1的过表达和缺失与肝癌等肿瘤的发生、发展密切相关[7-16]。lncRNA MCM3AP-AS1 在乳腺癌中表达上调，受雌激素正向调控，并与患者的无复发生存率较差有关[17]。lncRNA MCM3AP-AS1 在弥漫性胶质瘤标本中随着肿瘤分级的升高表达下调，与患者预后及恶性进展有显著相关性[18]。对肺腺癌的lncRNA 生物标志物的研究中发现 lncRNA MCM3AP-AS1 在肺腺癌中与 LINC00649 存在竞争关系，具体的作用机制尚未阐明[14]。本研究发现lncRNA MCM3AP-AS1在A549肺癌细胞中表达上调，且高表达lncRNA MCM3AP-AS1能够促进肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，低表达lncRNA MCM3AP-AS1能够抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。lncRNA MCM3AP-AS1升高可能与肺癌的预后较差有关，表明lncRNA MCM3AP-AS1可以作为NSCLC治疗中的新型生物标志物和治疗靶点。

综上所述，过表达 NSCLC 细胞中的lncRNA MCM3AP-AS1 水平可以促进NSCLC 细胞的增殖、侵袭及迁移，低表达NSCLC 细胞中的lncRNA MCM3AP-AS1 水平可以抑制NSCLC 细胞的增殖、侵袭及迁移。在将来的实验过程中可以从以下几个方面进一步探讨lncRNA MCM3AP-AS1的致癌性：(1)收集一定数量的肺癌组织及癌旁组织，利用qRT-PCR 检测lncRNA MCM3AP-AS1在肺癌组织、癌旁组织及不同细胞株的表达水平；(2)分析lncRNA MCM3AP-AS1差异表达与肺癌病理特征间的关系，了解 lncRNA MCM3AP-AS1对肺癌患者预后的影响(病理特征、性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移等、生存期与生存率的关系)；(3)利用流式细胞术研究 lncRNA MCM3AP-AS1的过表达和缺失对肺癌细胞凋亡的影响并且利用Western blot研究其对凋亡相关蛋白(Caspase-3、Caspase-9)表达的影响；(4)利用小鼠体内实验(肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤重量、免疫组化等)进一步研究lncRNA MCM3AP-AS1 在小鼠体内的表达对肺癌的影响。