不同HPLC-MS/MS法检测骨髓移植患者雷帕霉素血药浓度的相关性及意义*

王 磊，卢光泽，孙文利，刘红星,2,3△

1.河北燕达陆道培医院检验科，河北廊坊 065201；2.北京陆道培医院，北京100176；3.北京陆道培血液病研究院，北京 100176

雷帕霉素(RAP)作为大环内酯类免疫抑制剂，可减少骨髓移植后急性排斥反应和耐激素排斥反应的发生，亦可通过抑制mTOR激酶活性进而抑制肿瘤细胞生长，还兼具低肾脏毒性和糖代谢保护作用等优点[1-2]。而RAP血药浓度过低易发生急性排斥反应，浓度过高又可导致血小板减少、白细胞减少等不良反应[3]。1995年，YATSCOFF等[4]就指出应监测RAP血药浓度，且推荐采用色谱法作为RAP血药浓度检测的标准方法；2001年，MAHALATI等[5]又指出RAP血药浓度检测可选用高效液相色谱法(紫外检测器)或质谱法；2005年，STENTON等[6]推荐了RAP血药浓度监测频率和范围，进一步推动了RAP血药浓度检测在临床的广泛应用。目前，用于RAP血药浓度检测的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法有采用同系物子囊霉素作内标，亦有采用RAP稳定同位素(RAP-d3)作内标。本研究团队前期亦建立了以子囊霉素为内标的HPLC-MS/MS法用于RAP血药浓度测定[7]。由于RAP-d3色谱性能更接近于RAP，为更好地避免基质效应及仪器等对RAP血药浓度测定的影响，本研究特建立以同位素RAP-d3为内标的HPLC-MS/MS法，同时对两种内标的HPLC-MS/MS法检测结果进行分析，以确定哪种内标的HPLC-MS/MS法更适合用于骨髓移植患者的RAP血药浓度测定。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2020年10月至2021年2月送河北燕达陆道培医院药理室检测RAP血药浓度的骨髓移植患者新鲜剩余全血标本，共173份。要求血标本无黄疸、无乳糜、无溶血及凝血，剩余全血量不小于1 mL。

1.2仪器与试剂 采用4000 Q TRAP质谱仪(美国AB Sciex公司)，岛津 20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，AnalystV1.5.2 工作站(美国 AB 公司)，涡旋振荡器(其林贝尔)，微量台式低温离心机(Thermo Fisher)。 RAP校准品和质控品为ClinCal®-Calibrator(RECIPE CHEMICALS+INSTRUMENTS GmbH)和ClinChek®-Control(RECIPE，CHEMICALS+INSTRUMENTS GmbH)；RAP-d3(HPLC Grade，Toronto Research)。其余试剂及仪器详见本研究团队前期研究[7]。

1.3方法 分别采用内标为RAP-d3和子囊霉素的HPLC-MS/MS法同时对173份标本进行RAP血药浓度检测。RAP-d3为内标的HPLC-MS/MS法测定RAP血药浓度的参数：RAP-d3质子数/电荷数(m/z)为934.6>864.6，其余质谱参数、色谱系统参数及性能验证方法同以子囊霉素为内标的HPLC-MS/MS法[7]。残留结果验证需符合FDA方法学验证的指导原则[8-9]。根据STENTON等[6]在2005年推荐的RAP血药浓度监测范围，并结合河北燕达陆道培医院实际监测情况，把两种HPLC-MS/MS法检测RAP血药浓度结果分成<4、4～10、>10 ng/mL。

1.4统计学处理 使用SPSS 22.0 对两种方法检测173份标本RAP血药浓度的结果通过配对t检验进行差异分析，以P<0.05为差异有统计学意义；同时对两种方法检测结果进行相关性分析，并把两种方法检测结果分布情况绘制成山峦图，以观察其数据分布及对比两种HPLC-MS/MS法检测结果的一致性。

2 结 果

2.1以RAP-d3为内标的HPLC-MS/MS法性能验证结果 通过对3条标准曲线进行拟合，计算线性回归的相关系数(r)。方法确证曲线为Y=0.126X+0.064 3，r2=0.998 8，结果表明，RAP血药浓度在0～54.9 ng/mL线性关系良好。RAP出峰保留时间为1.73 min，内标RAP-d3保留时间为1.73 min，二者峰高比恒定，确定RAP-d3作为RAP的内标较为合适。同时亦表明，全血中的基质对RAP及内标RAP-d3的测定不产生干扰，专属性较好，内标归一化的基质因子在0.90～1.00，基质效应对最终结果影响较小。RAP日内CV为2.28%～2.89%，回收率为98.52%～104.61%；日间CV为2.37%～3.39%，回收率为97.04%～103.52%；二者CV均小于4%，回收率位于98%～105%，回收率高。稳定性实验所测得结果回收率为100%～110%，CV均小于5%。残留结果验证：空白标本的峰面积小于最低定量下限峰面积的20%，内标残留结果为0，符合FDA方法学验证的指导原则。

2.2差异分析 以子囊霉素为内标的HPLC-MS/MS法和以RAP-d3为内标的HPLC-MS/MS法检测173例骨髓移植患者RAP血药浓度结果，两种方法检测结果数据均符合正态分布，其均值分别为4.16 ng/mL和4.30 ng/mL，差异无统计学意义(t=2.127，P=0.35>0.05)。

2.3相关性分析 根据两种HPLC-MS/MS法检测结果绘制散点图，以子囊霉素为内标的HPLC-MS/MS法测定结果为自变量X，以RAP-d3为内标的HPLC-MS/MS法测定结果为函数Y，进行线性回归，回归方程为Y=0.932X+0.158，两种HPLC-MS/MS法检测结果相关性较好(r2=0.915)。见图1。

图1 两种HPLC-MS/MS法检测结果相关性分析

注：1组为<4 ng/mL；2组为4～10 ng/mL；3组为>10 ng/mL。

2.4一致性分析 HPLC-MS/MS(RAP-d3)方法检测RAP血药浓度，173份标本中，RAP血药浓度<4 ng/mL的占50.87%，4～10 ng/mL的占44.55%，>10 ng/mL的占4.58%。HPLC-MS/MS(子囊霉素)方法检测RAP血药浓度，173份标本中，RAP血药浓度<4 ng/mL的占54.91%，4～10 ng/mL的占42.20%，>10 ng/mL的占2.89%。两种HPLC-MS/MS法检测结果主要集中于<4 ng/mL和4～10 ng/mL两部分，两种检测方法这两部分结果基本重叠，一致性较好，而>10 ng/mL数据比较分散，一致性较差，说明两种方法在检测高RAP血药浓度时可能存在差异。见图2。

3 讨 论

骨髓移植作为可能根治恶性血液病的一种有效治疗手段，其移植后的移植物抗宿主病(GVHD)是影响移植物存活和患者生存质量的主要原因[10]。而RAP作为一种强效、低毒的免疫抑制剂，往往与环孢素或其他低效的免疫抑制剂联用于GVHD的预防和治疗[11]。但RAP像其他免疫抑制剂一样，具有治疗窗窄、个体差异大等特点，须在用药的过程中进行血药浓度监测，避免不良反应，提高移植成功率。

目前RAP血药浓度检测方法主要有色谱法和HPLC-MS/MS法，内标的选择多为子囊霉素和同位素RAP-d3，鲜见关于此两种不同内标对HPLC-MS/MS法检测结果影响的报道。本研究建立的以RAP-d3为内标的HPLC-MS/MS法特异性强，重现性好，能准确、灵敏、快速地检测骨髓移植患者全血RAP浓度。子囊霉素是一种RAP的乙基类似物，结构上与RAP相似[12]；而RAP-d3拥有与RAP相同的物理化学性质，其离子化效率和分离度几乎一样，可以最大限度消除分析方法的误差。就两者理化结构和化学性质进行比较，稳定性同位素为理想内标首选，而我国2015版《中华人民共和国药典》对生物样品定量分析中使用同位素内标也有相关规定：当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内标[8]。稳定性同位素作为内标使用后，由于待测组分与内标是同一种物质，两者离子丰度比相同，误判率极小，可以进一步确证化合物，所以，当两种内标法所测结果不一致时，推荐以稳定同位素内标法所测结果为准。

根据国内RAP临床试验结果,建议RAP全血谷浓度术后0～3个月控制在5～10 ng/mL，术后4～6个月控制在3～8 ng/mL，而本次试验随机选取173份骨髓移植患者的全血中RAP浓度(RAP-d3为内标的HPLC-MS/MS法)≤10 ng/mL占95.42%，说明河北燕达陆道培医院对RAP浓度控制较为理想[13]。进一步对173份全血RAP血药浓度结果分析可看出，以RAP-d3为内标的HPLC-MS/MS法检测结果与以子囊霉素为内标的HPLC-MS/MS法检测结果相关性较好，结果差异小，但是对于RAP血药浓度>10 ng/mL的患者标本而言，两种方法一致性较差，可能存在差别。究其原因，可能跟子囊霉素为RAP的结构类似物，其物理化学性质与RAP存在细微差别，导致其色谱行为不一致有关；而RAP-d3作为RAP的同位素，其物理化学性质和色谱学行为与RAP一致性更好，受仪器状态和前处理环节影响更小，结果相对更可靠。在针对RAP血药浓度监测内标的选择上，本研究选择的为氘代内标，可能不如13C内标的检测效果，后期本研究团队会继续对氘代内标和13C内标的选择做进一步研究，以期为临床RAP血药浓度测定内标的选择提供参考，让检测结果更可靠。