血清miR-224、miR-29c表达在ST段抬高型心肌梗死患者预后评估中的价值

董曜玮，李世权，李亚坤，李书辉

河南省郑州阳城医院心血管内科，河南郑州 452470

急性冠脉综合征(ACS)是临床较为常见的心血管疾病，多因冠状动脉阻塞而引起，而不稳定性斑块破裂或糜烂则导致血栓形成，因此增加斑块稳定性可降低心血管疾病发生风险[1]。ST段抬高型心肌梗死(STEMI)是一类具有典型缺血性胸痛的急性心肌梗死，经皮冠状动脉介入治疗(PCI)是临床治疗STEMI的有效手段，临床应用广泛，但仍有部分患者经PCI治疗后发生不良心血管事件(MACE)，这已成为困扰临床工作者的难题。微小RNA(miRNAs)对真核细胞的基因表达以及细胞发育等多方面有调控作用[2]。微小RNA-224(miR-224)在多种肿瘤中呈异常表达，有研究表明，miR-224可靶向调控前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)，影响脂质代谢，从而参与动脉粥样硬化进程[3]。微小RNA-29c(miR-29c)在多种疾病中呈异常表达，其可能参与调节斑块的稳定性[4]。但是目前临床关于miR-29c、miR-224与STEMI预后的关系尚不明确，因此本研究重点探讨miR-29c、miR-224对STEMI患者预后的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年1月至2019年12月于本院就诊的STEMI且行PCI治疗的患者222例为研究对象，其中男127例、女95例，年龄55～82岁、平均年龄(64.80±8.69)岁。纳入标准：(1)首次发病并确诊为STEMI；(2)均行PCI治疗；(3)发病到入院时间在24 h内；(4)患者临床资料完整，可坚持定期随访。排除标准：(1)合并有慢性、急性感染；(2)存在心肌梗死既往发病史或继发性STEMI；(3)合并有结缔组织疾病或恶性肿瘤、血液系统疾病；(4)需长期使用免疫抑制剂相关药物。本研究经医院伦理委员会批准，患者及其家属均知情同意。所有患者均随访12个月，并根据随访期间是否发生主要MACE分为MACE组和未发生MACE组。

1.2方法

1.2.1一般资料及实验室指标收集 收集并记录各组患者性别、年龄、体质量指数(BMI)、病史及术后用药情况，同时采用日立7600全自动生化仪检测患者血脂指标，包括三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。其中TG、LDL-C根据《中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)》中标准分为高、低水平，TG≥1.7 mmol/L为高水平，LDL-C≥3.4 mmol/L为高水平，反之则为低水平[5]。采用彩色多普勒超声诊断仪检测患者心功能指标[左室射血分数(LVEF)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期容积(LVESV)、左心室舒张末期容积(LVEDV)]；采用Philips H 5000F型心血管造影仪以Judkins法经桡动脉进行冠状动脉造影检查，采用Gensini评分系统[6]评估STEMI患者冠状动脉病变程度。

1.2.2血清miR-224、miR-29c检测 所有患者均在入院24 h内空腹抽取静脉血5 mL，离心机下以3 000 r/min转速离心10 min，提取上清液保存于-80 ℃待测。血清miR-224、miR-29c均采用荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测。首先在无菌环境中采用Trizol法提取血清中RNA(试剂盒购自日本TaKaRa公司)，然后在Roche LightCycler 480Ⅱ型荧光定量PCR仪中反转录为cDNA，反转录反应条件为16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。并采用qRT-PCR仪对miR-224、miR-29c以及内参U6进行扩增反应，引物由武汉博士德生物工程有限公司合成。miR-224上游引物5′-ACATCTACGACGTAGAGATG-3′，下游引物5′-GT ATACTTGCTATCCACG-3′；miR-29c上游引物5′-GTAGCACCATTTGAAATCAG-3′，下游引物5′-TTGGCACTAGCACATT-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACG AATTTGCGT-3′。扩增反应程序：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s 循环45次。最后采用2-ΔΔCt法计算血清miR-224、miR-29c的相对表达水平。实验过程中严格按照说明书进行操作。

1.2.3随访 随访时间从患者术后第1天开始计算，随访期为12个月，患者均行常规冠状动脉造影复查，每3个月定期检查一次，或自愿复查，或患者由于再次胸痛、胸闷等症状复查。以STEMI患者出现MACE为终点事件，包括严重心律失常、非致死性心肌梗死、非计划再次血运重建、全因死亡及心源性死亡等，随访终点以出现终点事件或随访12个月为止。以MACE作为评估患者预后的指标，根据患者第1次出现MACE的时间计算无进展生存期。

2 结 果

2.1一般资料比较 222例行PCI治疗的STEMI患者均进行12个月随访，52例(23.42%)患者发生MACE。MACE组的TG、LDL-C水平显著高于非MACE组(P<0.05)，LVEF显著低于非MACE组(P<0.05)，表1中其他各项指标两组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 MACE组和非MACE组患者一般资料比较[n(%)或

2.2miR-224、miR-29c水平比较 MACE组血清miR-224、miR-29c水平明显低于非MACE组(P<0.05)，见表2。

2.3血清miR-224、miR-29c水平与STEMI患者预后情况的关联分析 miR-224高水平患者在随访12个月内MACE发生率为14.41%，无进展生存期均值为11.450个月(95%CI：11.162～11.739)；miR-224低水平MACE发生率为32.43%，无进展生存期均值为10.847个月(95%CI：10.466～11.227)。miR-224高水平患者和miR-224低水平患者的生存曲线不同，miR-224高水平患者的无进展生存率高于miR-224低水平患者(Log-rank检验χ2=9.749，P=0.002),见图1。miR-29c高水平患者在随访12个月内MACE发生率为11.71%，无进展生存期均值为11.495个月(95%CI：11.215～11.776)；miR-29c低水平患者MACE发生率为35.14%，无进展生存期均值为10.802个月(95%CI：10.418～11.186)。miR-29c高水平患者和miR-29c低水平患者的生存曲线不同，miR-29c高水平患者的无进展生存率高于miR-29c低水平患者(Log-rank检验χ2=15.933，P<0.001)，见图2。

表2 两组血清miR-224、miR-29c水平比较

图1miR-224与STEMI患者预后发生MACE的K-M曲线

2.4STEMI患者预后的危险因素分析 以STEMI患者是否发生MACE(是为1，否为0)作为因变量，以表1、2中差异有统计学意义的LVEF、TG、LDL-C、miR-224、miR-29c为自变量进行COX回归分析，依据各值平均数分为高、低水平。将高LVEF、TG低水平、LDL-C低水平、miR-224高水平、miR-29c高水平均赋值为0，反之为1。结果显示，低LVEF、LDL-C高水平、miR-224低水平、miR-29c低水平均是STEMI患者预后的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

图2 miR-29c与STEMI患者预后发生MACE的K-M曲线

表3 多因素分析结果

3 讨 论

近年来STEMI发病率及病死率呈逐年上升趋势，临床特征表现为发病急、病情变化速度快、预后差等，由于动脉粥样硬化斑块破裂使血小板黏附、聚集，形成血栓，进而致冠状动脉阻塞，不仅是STEMI发病原因，也是导致患者死亡的重要原因之一，寻找快速、有效评估STEMI病情的生物标志物以改善患者预后成为当前研究重点[7]。研究显示，斑块稳定性受多种因素影响，新生血管结构、功能及数量均影响斑块稳定性，结构异常的新生血管显著促进斑块进展[8-9]。本研究222例STEMI患者在12个月随访期内，有52例患者发生MACE，发生率为23.42%，可见部分患者存在不良结局，威胁患者生命健康。

miRNAs在真核生物中广泛存在，仅占人类基因组1%～3%，却参与调控1/3基因的表达。miRNAs具有抗酸碱、抗冻融处理及抗RNA酶的特点，在血清中能够相对稳定地存在，加上血液标本获取便捷，使研究血清中miRNAs的水平具有可行性[5]。miR-224定位于X染色体，在宫颈癌、胃癌、前列腺癌等多种肿瘤中异常表达，在不同的肿瘤中发挥促癌或抑癌作用，同时关于其与动脉粥样硬化的关系已成为研究热点[10-11]。miR-29c定位于1q32.2染色体，在肺癌[12]、胰腺癌[13]、糖尿病肾病[14]等多种疾病中表达异常。有研究表明，miR-29c通过调控靶基因ColⅠ、ColⅢ、ColⅣ、ColⅤ等表达，促进细胞外基质表达并在内皮细胞外堆积，进而影响斑块稳定性[5]。本研究发现，MACE组与非MACE组相比，LVEF、miR-224、miR-29c水平均较低(P<0.05)，TG、LDL-C水平均较高(P<0.05)，提示LVEF、miR-224、miR-29c、TG、LDL-C可能与STEMI患者预后状况密切相关。推测原因是Kexin样前转化酶枯草杆菌蛋白酶家族的第9个成员(PCSK9)可与低密度脂蛋白受体结合促进其进入溶酶体而发生降解，进而使低密度脂蛋白受体介导的胆固醇清除减少，血浆脂质增加，最终影响斑块稳定性，增加心血管疾病发生风险，而miR-224可靶向抑制PCSK9表达；因此，低表达的miR-224对STEMI病情产生促进作用[3-4,11]。miR-29c可能通过调控细胞外基质表达及新生血管形成，影响斑块稳定性，进而参与STEMI。K-M曲线结果显示，miR-224、miR-29c高水平均提示患者具有较好预后。另经COX回归模型分析显示，低LVEF、LDL-C高水平、miR-224低水平、miR-29c低水平均是STEMI患者预后的独立危险因素，表明miR-224、miR-29c可能成为预测STEMI患者预后的指标之一，同时也提示对于低LVEF、LDL-C高水平的STEMI患者应密切关注，进行有效干预可预防MACE的发生。

综上所述，血清miR-224低水平、miR-29c低水平是STEMI患者预后的独立危险因素，推测二者可能成为预测STEMI患者预后的潜在指标。但本研究为单中心、小样本量研究，可能造成结果偏差，值得后续扩大样本量或进行多中心病例对照研究以论证该结果。