精神分裂症患者血浆微小RNA-195、脑源性神经营养因子表达及与复发的相关性

邵灿，马明芳，郭丽阳，王晓萌

精神分裂症是一种慢性严重精神疾病，涉及多方面如思维、情感、认知、行为等障碍，与其他精神病性障碍的加权终生患病率达0.7%左右[1]，且具有高复发率、高致残率等特点，病情多迁延并呈慢性化，严重者导致精神残疾，给患者及家庭带来严重负担[2]。研究表明，精神分裂症患者治愈后1年内复发率高达20%～50%，病情反复发作易致患者人格、职业及社会功能损害[3]。因此，寻找可靠的分子生物学指标深入探讨精神分裂症发病机制并评估早期病情进展，以采取相应干预措施，对改善预后具有重要意义。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类高度保守、内源性的非编码核苷酸，对生物体的生长、发育、分化发挥重要调节作用，并涉及神经元可塑性及信号转导过程[4]。研究证实多种miRNA异常表达可能与精神分裂症发病有关[5]。有研究报道miR-195-5p可能通过抑制精神分裂症治疗药物的受体基因的表达而引起耐药性[6]。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神经营养素家族主要成员之一，能够促进中枢神经系统生长发育，在脑神经细胞生长、发育及神经递质释放、突触可塑性方面有重要作用，与多种神经精神疾病发病有关[7]。目前同时研究miR-195、BDNF与患者复发的关系鲜有报道，因此本研究探讨精神分裂症患者血浆miR-195、BDNF表达与复发相关性，以期为预防和降低精神分裂症患者愈后复发提供参考。

1 对象和方法

1.1 对象

1.2 方法

1.2.1 资料收集 收集受试者一般资料，包括性别、年龄、BMI、家庭经济状况、饮酒史、家族史、病程、起病形式。

1.2.2 血浆BDNF水平检测 患者确诊次日、体检者体检当天采集空腹外周静脉血5 ml于EDTA抗凝管中，室温条件下以4 000 r/min离心10 min后取上层血浆，均于-80 ℃冰箱中保存，备用。从-80 ℃冰箱中取出冻存血浆，解冻，采用酶联免疫吸附(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)法测定受试者血浆中BDNF水平。所有操作均严格按照试剂盒(上海岚派生物科技有限公司)说明书进行。

1.2.3 血浆miR-195表达水平测定 采用TRIzol试剂(美国Sigma公司)提取血浆总RNA，以RNA为模板，按照PrimeScript RT reagent试剂盒(苏州泓迅生物科技股份有限公司)说明书进行逆转录反应得cDNA。参照实时荧光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR)试剂盒(美国Sigma公司)说明进行qRT-PCR反应。反应体系为20 μl：SYBR Premix 10 μl，cDNA 1 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl。反应程序：95 ℃预处理20 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40个循环。以U6作为内参基因，以(RQ)=2-ΔΔCt方法表示血浆miR-195相对表达量。miR-195(正向引物5'-3'：TGACAAAGGCAG-GAGGTA，反向引物5'-3'：ATCTCTGGGTGCTGG-TGAAGG)、U6(正向引物5'-3'：AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC，反向引物5'-3'：GGGGTCATTGATGGCAACAATA)引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4 随访 参照中国人民解放军总后卫生部《临床疾病诊断依据治愈好转标准》[9]中有关精神分裂症治愈标准，患者完成所有治疗后，接受常规随访，随访时间24个月，每2个月入院复查1次，对观察组受试者的精神状况作简明精神量表(the brief psychiatric rating scale，BPRS)评分[10]，总分18～126分，总分越高病情越重。根据ICD-10诊断标准，BPRS评分>35分为复发，记录患者复发情况，将患者分为复发组29例、未复发组89例。

2 结果

2.1 观察组与对照组血浆miR-195、BDNF水平比较

与对照组比较，观察组血浆miR-195水平显著较高(P<0.01)，BDNF水平显著较低(P<0.01)。见表1。

表1 两组血浆miR-195、BDNF水平比较

2.2 复发组与未复发组一般资料比较

两组一般资料比较，年龄、性别、BMI、家庭经济状况、饮酒史、起病形式差异无统计学意义(P>0.05)；家族史、病程比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 两组一般资料、BDNF水平与miR-195比较(例数

2.3 复发组与未复发组血浆miR-195、BDNF水平比较

与未复发组比较，复发组血浆miR-195水平显著升高(P<0.01)，BDNF水平显著降低(P<0.01)。见表2。

2.4 患者血浆miR-195、BDNF表达相关性分析

生物信息学预测(miRanda网站)显示，miR-195、BDNF存在结合位点。Pearson相关性分析显示观察组患者血浆miR-195与BDNF表达水平呈负相关(r=-0.526，P<0.05)。见图1。

图1 血浆miR-195、BDNF预测结合位点

2.5 影响精神分裂症患者复发的COX危险因素分析

以精神分裂症患者是否复发(否=0，是=1)作为因变量，以年龄(<38岁=0，≥38岁=1)、性别(男=0，女=1)、BMI(实测值)、饮酒史(无=0，有=1)、家族史(无=0，有=1)、起病形式(慢性=0，急性=1)、病程(3个月以下=0，3个月至1年=1，1年至5年=2)、miR-195(实测值)、BDNF(实测值)作为自变量进行COX危险因素分析。

单因素COX分析显示，起病急、病程长、miR-195高表达、BDNF水平低表达是精神分裂症患者复发的危险因素；多因素COX分析显示，miR-195高表达、BDNF低水平是精神分裂症患者复发的独立危险因素。见表3。

表3 影响精神分裂症患者复发的COX危险因素分析

3 讨论

精神分裂症是一种重症精神疾病，发病机制尚未明确，具有易复发特点，给患者、家庭及社会带来严重影响。目前临床对精神分裂症病因研究已不局限于遗传学方面，在基因调控方面也渐渐深入。因此本研究对118例精神分裂症治愈患者跟踪随访2年，分析血浆miR-195、BDNF表达与患者复发的关系，以期为减少精神分裂症患者复发风险提供帮助。

本研究结果显示，相比未复发组，复发组患者有家族史者更多、病程更长；与杨汝阳等[11]研究显示精神分裂症患者遗传易感性与该病发生有关结果一致，提示遗传因素会增加精神分裂症发生风险；病程较长的患者容易反复发作且迁延难愈，预后较差。

miR-195是较早发现的在精神分裂症患者体内异常表达的miRNA。研究表明其转录后能抑制BDNF表达，影响脑神经元的发育[12]。鲍晨曦等[13]研究发现，与正常对照组比较，精神分裂症患者外周血中miR-195表达水平显著升高，且miR-195与精神分裂症发生发展关系密切。本研究结果显示，与对照组比较，观察组血浆miR-195水平显著升高，且复发组血浆miR-195水平显著高于未复发组患者。提示血浆miR-195水平异常高表达与精神分裂症发生发展关系密切，且可能与患者复发有关。

BDNF可能促进皮质神经元、海马神经元、胆碱能神经元、黑质多巴胺能神经元及5-羟色胺(5-HT)能神经元的存活和发育，并能防止它们受损死亡。本研究结果显示，与对照组比较，观察组血浆BDNF水平显著降低，且复发组血浆BDNF水平显著低于未复发组，与周蓉等[14]研究结果一致；提示血浆BDNF水平异常低表达与精神分裂症发生发展关系密切，且可能与患者复发有关。原因可能是BDNF水平降低使突触后神经元多巴胺D2受体表达增加，导致精神分裂症患者病情加重、复发[15]。瞿准等[16]研究发现，创伤性脑损伤患者血浆miR-195异常高表达，BDNF异常低表达，认为miR-195可能抑制BDNF表达进而抑制皮质神经元、海马神经元、胆碱能神经元、黑质多巴胺能神经元及5-HT能神经元的存活和发育，并促使它们受损死亡。本研究生物信息学预测也显示，miR-195、BDNF存在结合位点，Pearson相关性分析显示精神分裂症患者血浆miR-195水平与BDNF表达呈负相关。本研究进一步COX危险因素分析显示，miR-195高表达、BDNF水平低是精神分裂症患者复发的独立危险因素；提示可通过检测患者血浆miR-195、BDNF水平评估患者复发情况。对于血浆miR-195水平较高和BDNF水平较低的患者，应提早给予干预进行改善。

综上所述，精神分裂症患者血浆miR-195异常高表达、BDNF水平异常低表达，检测二者水平对评估患者复发情况有所帮助。然而本研究也有不足之处，如本研究并未对miR-195、BDNF在精神分裂症患者中的具体作用机制进行研究，后期应进行深入探讨；由于试验成本及时间限制，本研究样本量不足、研究对象范围较小，若需应用于临床还需进一步扩大样本量并加入不同地区样本进行验证。