不同温度下AOX和COX途径对苜蓿种子萌发和幼根生长的影响

赵文静, 张浩阳, 徐燕妮, 罗 蛟, 刘美君*

(1.新疆农业大学草业学院， 新疆草地资源与生态重点实验室， 西部干旱荒漠区草地资源与生态教育部重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830052； 2.山东农业大学生命科学学院， 作物生物学国家重点实验室， 山东 泰安 271018)

苜蓿(MedicagosativaL.)作为重要的多年生优质豆科牧草，其产业对我国经济发展和生态环境建设与保护起着重要的作用[1]。紫花苜蓿广泛分布于我国西北、华北、东北等地，也是新疆分布最广的栽培牧草，在南北疆平原和山区均有分布[2]，然而由于新疆春秋气温低且不稳定，夏季高温炎热，导致一些优良的紫花苜蓿品种在生长发育阶段易遭受低温或高温的影响，这严重降低了苜蓿的产量和质量。

种子萌发在植物繁衍和种群更新中起着至关重要的作用，故其对作物的生长和产量有重要的影响[3]。温度是影响种子萌发生长的关键环境因子之一，外界温度过高或过低均会显著降低种子的萌发活性，导致种子萌发生理发生变化[4-5]。万茜等研究发现，高、低温胁迫都会导致豇豆(Vignaunguiculata)幼苗体内丙二醛含量的上升，但其体内可溶性蛋白质含量、过氧化物酶、过氧化氢酶活性变化不一致[6]。肖梦颖等研究发现，高粱种子萌发时，遭受低温胁迫会导致超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性上升[7]。温度与其它胁迫结合会加重对种子萌发的抑制[8-11]。然而，目前有关紫花苜蓿种子萌发的研究主要集中在抗寒[12]、干旱[13]、盐碱[14-15]等方面，而有关高、低温胁迫对苜蓿种子萌发的影响研究较少，且研究不深入。

种子萌发是一个需能的过程，线粒体呼吸代谢是种子萌发的唯一能量来源。植物呼吸代谢具有多样性，除了糖酵解途径(Glycolysis pathway，EMP)，磷酸戊糖途径(Pentose phosphate pathway，PPP)，三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle，TCA)3条主要的呼吸途径外，交替氧化酶(Alternative oxidase，AOX)途径和细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase，COX)途径也是植物呼吸代谢的2条重要途径。前人研究表明，在适宜植物种子萌发温度下，AOX和COX途径均在种子萌发过程中发挥重要作用，水稻(Oryzasativa)种子刚长出胚芽和胚根时，COX的活性会达到高峰[16]，甜菜(BetavulgarisL.)种子的吸胀萌发与COX的活性大小密切相关[17]；也有研究认为AOX途径在鹰嘴豆(Cicerarietinum)、棉花(Gossypiumhirsutum)、大豆(Glycinemax)种子的萌发过程中起关键作用[18-20]。

然而，目前针对线粒体AOX和COX途径在不同温度下对种子萌发的作用的研究较少，而且温度是否会影响AOX和COX途径对种子萌发的作用尚不清楚。因此，本研究以‘甘农5号’和‘新牧4号’紫花苜蓿为供试材料，分别采用水杨基氧羟肟酸(SHAM)、氰化钠(NaCN)专一性抑制剂部分抑制AOX和COX途径，探究了不同温度下AOX和COX途径对种子发芽速率和幼根生长的影响。阐明这一问题将丰富我们对种子萌发机制的理解，而且研究不同温度下不同秋眠级紫花苜蓿种子萌发的生理机制，对苜蓿品种的引种选育具有较强的实际意义，对草地的建植以及维持草地生态功能有重要的理论意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以‘甘农5号’(GN5)和‘新牧4号’(XM4)紫花苜蓿为试验材料，其中XM4由新疆农业大学草业学院2018年收获并提供，GN5由甘肃农业大学草业学院2018年收获并提供，且2种紫花苜蓿的发芽率均在95%以上，至2019年3月进行试验前2种紫花苜蓿都存放于新疆农业大学牧草种子库。

1.2 试验设计

2种紫花苜蓿各选取50粒颗粒饱满[21]，大小均匀的种子，用75%的酒精消毒约30 s，然后用无菌蒸馏水冲洗3次后将种子整齐的置于直径为90 mm铺有双层滤纸的培养皿中，每个培养皿中加入3 mL去离子水或者处理溶液，最后将培养皿置于光周期12 h·d-1，光照强度为50 μmol·m-2·s-1的恒温培养箱中。

由于新疆位于我国西北内陆(73°E～96°E，34°N～48°N)，属温带大陆性气候，气温温差大，历史上夏季最高气温为41℃，春季最低气温为-28℃。因此在预试验中分别设置了5℃，15℃，25℃，35℃，40℃5个温度梯度进行了种子萌发的预试验，并最终选取10℃，25℃，40℃进行正式试验，每个温度下每个试剂处理设置3个重复，共计63个培养皿。自种子置培养皿之时开始计时，每24 h观察记录种子的萌发情况，以胚根突破种皮露白作为萌发的标准[22]，持续观察5 d，期间每48 h更换一次滤纸，并补充3 mL相应的处理溶液，5 d后每个培养皿随机选择10株幼苗，用游标卡尺测量其根长。

本试验共设置7种不同的处理(详见表1)，其中SHAM不溶于水，需要乙醇助溶。

表1 7种不同的试剂处理对紫花苜蓿种子萌发和幼根生长的影响Table 1 Effects of 7 different reagent treatments on seed germination and root growth of alfalfa

1.3 测定指标

种子萌发指标按如下计算公式。

(1)发芽率(%)=当天发芽种子数/供试种子数×100%[25];

(2)发芽抑制率=(第n d CK下的发芽率-第n d处理组的发芽率)/第n d CK下的发芽率×100%，n=5[26];

(3)根长抑制率=(第6 d CK的根长—第6 d处理的根长)/第6 d CK的根长×100%[27]。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2003软件整理数据，SPSS 19.0软件进行单因素方差(ANOVA)统计分析，Duncan法多重比较，差异显著性定义为P<0.05，采用软件Sigmaplot 10.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同温度对紫花苜蓿种子萌发的影响

不同温度处理下，2种紫花苜蓿的种子均在第3 d完全萌发。与25℃相比，40℃，10℃均显著降低了种子第1 d和第2 d的发芽率(P<0.05)，但对3 d之后的种子发芽率无显著影响(图1)。这表明非适宜温度会降低紫花苜蓿种子的发芽速率，但对种子最终发芽率无明显影响，且2种紫花苜蓿品种不同温度下的发芽率结果基本相似。

图1 10℃，25℃，40℃下紫花苜蓿种子发芽率的影响Fig.1 Effect of 10℃,25℃ or 40℃ on the germination rate of alfalfa seeds注：图A为‘新牧4号’，图B为‘甘农5号’。不同小写字母表示不同温度和不同萌发时间下紫花苜蓿发芽率差异显著(P<0.05)Note:Fig.1A for ‘Xinmu No.4’;Fig. B for ‘Gannong No.5’. Different lowercase letters indicate significant differences in the germination rate of alfalfa under different temperatures and different germination times at the 0.05 level

2.2 不同温度下AOX和COX途径受抑制对紫花苜蓿种子发芽速率的影响

由图2可知，2种紫花苜蓿种子发芽的第1 d，25℃下NaCN和SHAM处理均显著抑制了XM4和GN5种子的发芽率(图2B)(P<0.05)。10℃下NaCN处理对2种紫花苜蓿种子的发芽率有着显著地抑制作用(P<0.05)，而SHAM处理对2种紫花苜蓿种子的发芽率影响不显著(图2A)。40℃下，NaCN和SHAM处理均抑制了2种紫花苜蓿种子的发芽率(图2C)(P<0.05)。同一温度下NaCN处理对2种紫花苜蓿种子发芽率的影响相似，而SHAM处理对2种紫花苜蓿种子发芽率的影响存在差异。

不同温度下，种子发芽第5 d时，NaCN处理对2种紫花苜蓿种子发芽的抑制作用消失，但40℃下SHAM处理仍显著降低了2种紫花苜蓿种子的发芽率(图2G，H，I)(P<0.05)。

图2 10℃(A，D，G)，25℃(B，E，H)或40℃(C，F，I)下不同呼吸抑制剂处理对紫花苜蓿种子发芽率的影响Fig.2 Effect of different treatments on the germination rate of alfalfa seeds at 10℃(A,D,G),25℃(B,E,H)or 40℃(C,F,I)注：不同小写字母表示相同品种同一温度不同呼吸抑制剂处理下差异显著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate significant differences under different respiration inhibitor treatments at the same temperature at the 0.05 level

综上所述，AOX和COX途径在苜蓿种子萌发尤其是萌发初期有重要作用，并且温度会显著影响AOX和COX途径对种子萌发的作用。

为了更加清晰的对比AOX和COX途径对紫花苜蓿种子发芽的影响，本文分析了SHAM和NaCN处理对紫花苜蓿种子萌发过程中每1 d发芽率的抑制比例，并将5 d的抑制比例累加(图3)，结果表明，25℃下SHAM和NaCN处理种子的发芽抑制率基本相似(图3C，图3D)。与25℃相比，10℃下NaCN处理种子的发芽抑制率明显升高，但SHAM处理种子的发芽抑制率明显降低(图3A，图3B)。与25℃相比，40℃处理小幅提高了NaCN处理种子的发芽抑制率，但是大幅提高了SHAM处理种子的发芽抑制率(图3E，图3F)(P<0.05)。这表明，25℃下AOX和COX途径对紫花苜蓿种子发芽的作用大小相似，10℃下COX途径对紫花苜蓿种子萌发的作用大，而40℃下AOX途径对紫花苜蓿种子萌发的作用大；此外，不同温度下SHAM和NaCN处理对2种苜蓿种子萌发的影响基本一致。

图3 10℃(A，B)，25℃(C，D)，或40℃(E，F)下不同呼吸抑制剂处理对紫花苜蓿种子发芽的抑制率Fig.3 Inhibition of different respiration inhibitor treatments on the germination of alfalfa seeds at 10℃(A，B)，25℃(C，D)，or 40℃(E，F)注：图A，C，E为‘新牧4号’，图B，D，F为‘甘农5号’。不同小写字母表示同一温度不同处理下差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示同一处理不同温度下差异显著(P<0.05)Note:Figure A,C,E for ‘Xinmu NO.4’,Figure:B,D,F for ’Gannong No.5’. Different lowercase letters indicate significant differences under different treatments of the same temperature at the 0.05 level,while different capital letters indicate significant differences under different temperatures of the same treatment at the 0.05 level

2.3 不同温度对紫花苜蓿幼根长的影响

种子萌发后幼根快速生长以吸收水分和养分。在紫花苜蓿生长的第6 d，测定2种紫花苜蓿的幼根长。25℃下紫花苜蓿的幼根最长，10℃和40℃均明显降低了紫花苜蓿的幼根长(图4)(P<0.05)，且2种紫花苜蓿间无明显差异。这说明温度低于或高于适宜的发芽温度都会对种子的幼根生长产生抑制作用。

图4 10℃，25℃，40℃下用去离子水培养第6 d的紫花苜蓿种子幼根长Fig.4 Length of Roots of alfalfa cultivars seedlings was culture in deionized water at 10℃,25℃ and 40℃ for the 6th day注：不同小写字母表示不同紫花苜蓿在不同温度下培养第6 d的幼根长差异显著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate that the root lengths of different alfalfa are significantly different on the 6th day of cultivation at different temperatures at the 0.05 level

2.4 不同温度下AOX和COX途径受抑制对紫花苜蓿幼根长的影响

在25℃处理下，SHAM和NaCN处理均显著降低了2种苜蓿的幼根长(图5B)(P<0.05)；10℃下SHAM处理对2种苜蓿的幼根长度均有明显的抑制作用，NaCN处理对XM4的幼根长有显著抑制作用(P<0.05)，但对GN5幼根长的影响并不显著(图5A)；40℃下SHAM处理明显缩短了2种紫花苜蓿的幼根长，2 mmol·L-1的NaCN处理均显著降低了2种紫花苜蓿的幼根长(图5C)(P<0.05)，1 mmol·L-1的NaCN处理对2种紫花苜蓿的抑制作用不明显。

图5 10℃(A)，25℃(B)或40℃(C)下不同试剂处理对紫花苜蓿第6 d幼根长的影响Fig.5 Effects of different reagent treatments at 10℃(A),25℃(B) or 40℃(C) on the 6th day root length of alfalfa注：不同小写字母表示同一温度下不同处理间差异显著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate significant differences under different treatments of the same temperature at the 0.05 level

为了精确比较2种试剂对幼根生长的影响，本文分析了相对于对照组，SHAM和NaCN处理对紫花苜蓿幼根长的抑制比例。结果表明，在XM4中，与25℃相比，40℃和10℃均明显加重了SHAM对幼根长的抑制(图6A)(P<0.05)。在GN5中，SHAM处理对幼根的抑制程度在不同温度下类似；NaCN处理对幼根长的抑制程度在不同温度处理下无显著性差异(图6B)。另外，在不同温度处理下，2种紫花苜蓿中SHAM处理导致的幼根长的受抑程度均大于NaCN处理。

图6 10℃，25℃，或40℃下培养第6 d的紫花苜蓿幼苗的根长抑制率Fig.6 Inhibition rate of different reagent treatments on the 6th day root length of alfalfa at 10℃(A),25℃(B),and 40℃(C)注：图A为新牧4号，图B为甘农5号。不同小写字母表示同一温度不同处理下差异显著；不同大写字母表示同一处理不同温度下差异显著(P<0.05)Note:Figure A for Xinmu No.4,Figure B for Gannong No.5.Different lowercase letters indicate significant differences under different treatments of the same temperature at the 0.05 level,while different capital letters indicate significant differences under the different temperatures of the same treatment at the 0.05 level

3 讨论

种子萌发是植物生长的第一步，种子萌发从干种子开始吸水膨胀到胚轴突破种皮长成幼苗都离不开植物线粒体的呼吸作用[28]为其提供ATP。植物呼吸有2条重要的电子传递链，其中COX途径是植物呼吸电子传递的主链，为细胞新陈代谢提供能量[29]。而植物特有的AOX途径，在生物胁迫和非生物胁迫中发挥重要作用[30]。因此，文中利用呼吸途径专一性抑制剂SHAM，NaCN(所选抑制剂浓度可有效抑制AOX，COX途径且不会直接影响植物的其他代谢路径[31-32])对紫花苜蓿的AOX，COX呼吸途径进行了部分的抑制，结果表明NaCN和SHAM均明显降低了2种紫花苜蓿种子的发芽速率，这表明AOX和COX途径均在紫花苜蓿种子萌发中发挥重要作用，这与前人研究结果一致[2,33]。

温度是影响种子萌发的重要因素之一，不适的温度常常会影响种子萌发过程中水解酶性质、膜结合蛋白的活力及膜透性等，进而影响种子的发芽速率和胚根、胚芽的生长。本研究以及吕朝燕等[34]的研究都表明萌发温度过高或过低都会降低种子的萌发活性，影响种子萌发进程。前人研究发现温度会影响呼吸代谢过程中AOX和COX这2条呼吸途径，从而影响呼吸代谢，进而影响种子萌发过程[35]，在本研究中发现不同温度下，2条呼吸途径对温度的响应不同，低温下AOX途径比COX途径对紫花苜蓿种子萌发的贡献小，40℃下则相反。这是因为种子萌发需要大量的ATP维持复杂的生化代谢[36]，而低温胁迫下，EMP和TCA循环运转较慢[37]，产生的还原力较少，因此进入呼吸电子传递链的电子相对不足。此时，高效利用还原力产生尽可能多的ATP是种子萌发面临的最大挑战，因此在低温下抑制COX途径对种子的萌发速率影响较大。此外，低温胁迫下AOX途径对种子萌发的贡献小于COX途径，有可能是因为低温胁迫下AOX的活性降低，增强了线粒体应激信号通路，激发了抗氧化系统的表达[38]，从而维持了低温下细胞内COX途径功能的正常运行。与低温相反，高温会促进EMP途径和TCA循环的运转[39]，从而产生较多的ATP用于种子的萌发，此时COX途径合成ATP就不再是种子萌发的限制因素。但是高温会显著影响酶活以及蛋白复合体的活性，导致呼吸电子传递过程中发生电子渗漏，产生大量的ROS，从而造成氧化胁迫[40]。高温胁迫下，AOX的活性显著增加，能够有效的减少ROS的积累[41]，从而减轻高温对种子萌发的伤害，因此，与COX途径相比，高温胁迫下AOX途径对种子发芽速度的贡献更高，有效的增加了苜蓿种子发芽的耐热性。

种子萌发慢意味着幼苗根生长的时间短，因此我们预测温度和抑制剂对幼根生长与对种子萌发速度的影响类似。但本试验结果却发现，AOX和COX途径在种子萌芽期和幼根生长期的贡献是不同的，具体表现为与抑制COX途径相比，AOX途径受抑制会明显增加对幼根生长的抑制作用。AOX途径是非磷酸化途径，可以快速消耗还原力，从而解除高NADH/NAD+比值对TCA循环的限制[42]。而COX途径会受到ADP可用性和跨膜电动势的限制，其活性难以大幅提高[43]。因此AOX途径比COX途径能更有效的促进TCA循环。TCA循环是脂肪酸和氨基酸代谢所需碳骨架的主要来源[44]。在幼根生长阶段，需要合成大量的脂肪酸(用于合成生物膜)以及蛋白质。因此我们推测AOX途径可以通过促进TCA循环提供更多的碳骨架以促进幼根的生长。

4 结论

高、低温胁迫均会明显减慢紫花苜蓿种子的发芽速率和幼根生长。在萌芽期和幼根生长期AOX和COX途径都对种子萌发具有重要的作用，在种子萌发的初始阶段，AOX途径在高温条件下的贡献大，COX途径在低温条件下的贡献大；在幼苗生长阶段，不同温度下AOX途径对幼根生长的贡献均大于COX途径；此外，不同温度对种子发芽的影响以及AOX和COX途径对种子发芽的贡献在2种紫花苜蓿间无明显差异。