杂交构树青贮饲料中优良乳酸菌的分离与鉴定

张玉琳， 杨寒珺， 李超程， 张凡凡*， 马春晖*

(1. 石河子大学动物科技学院， 新疆 石河子 832000；2. 新疆科构生物科技有限公司， 新疆 石河子 832000)

杂交构树(Broussonetiapapyrifera)是桑科构树属的一种多年生木本植物，是由中国科学院植物研究所通过杂交育种技术开发的具有突出抗逆性及多用途的速生新品种[1]。杂交构树茎、叶粗蛋白质含量较高(20%以上)，且富含钙和各类氨基酸等营养物质[2]，将其用作饲料可在一定程度上缓解“人畜争粮”的矛盾，且可以丰富地区饲草资源，弥补目前我国蛋白质饲料短缺。当前，杂交构树全株的利用方式主要为调制青贮饲料。大量研究证实，经青贮发酵能够有效减缓杂交构树营养物质的流失，软化木质素或植物纤维，改善其适口性，提高家畜对饲料营养成分的消化率[3-5]。

理想的青贮饲料在发酵过程中，主要由乳酸菌主导，乳酸菌能有效调节青贮原料微生物区系，进而改善青贮的发酵进程，确保青贮饲料营养成分的保存；而这一过程中，不同乳酸菌类型、数量、活性、多样性等均会影响青贮饲料的发酵品质[6-8]，因此明确主导青贮发酵的乳酸菌对于青贮的调制是十分必要的。研究表明，乳酸菌在青贮体系中需尽快增殖占据支配地位，其数量必须达到105cfu·g-1FW以上[9-10]；而杂交构树原料表面附着乳酸菌数量较少(<105cfu·g-1FW)[11]，因此为确保青贮饲料的发酵品质，需要外源添加优良乳酸菌菌种。乳酸菌根据其发酵葡萄糖的形式可分为同质型和异质型。同质型乳酸菌主要通过糖酵解途径产生乳酸，青贮中如植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(Pedococcuspentosaceus)等同质型乳酸菌在发酵过程中能够迅速积累大量乳酸，从而降低发酵体系内的pH值，且能够有效降低乙醇和氨态氮的含量，并提高乳酸和乙酸的比值[12-13]。异质型乳酸菌基本都是通过磷酸解酮酶途径产生乳酸、乙酸等，其不仅比同质型发酵产酸能力差，且发酵过程中会产生CO2，增加了营养物质的损失。青贮中如布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)等异质型乳酸菌，虽然转化乳酸的效率较差，且消耗青贮饲料中的营养物质较多，但其产生的乙酸等挥发性脂肪酸能有效抑制霉菌的生长，且可通过提高青贮饲料的有氧稳定性以弥补潜在的营养损失[12-13]。因此，鉴于二者的优势有所不同，两类乳酸菌在青贮中往往联合使用[6-7]。然而，并不是任何条件下乳酸菌剂都可以发挥作用，且没有一种菌剂被认为是绝对有效的[14]，当青贮原料的可溶性碳水化合物、干物质含量达不到要求，或添加的菌株不能在原料上生长繁殖时，菌株均不能在青贮发酵体系中建立优势，其应有效果也得不到体现。因此，鉴于乳酸菌特性及适应环境的不同，需要设定不同营养条件，以确保其在不同发酵原料上的作用[15]。

为研制适应不同青贮原料的乳酸菌青贮制剂，近年来有关牧草中天然附着乳酸菌分离鉴定及其在青贮饲料中应用的研究诸多，其中不乏从不同的牧草原料中筛选出耐低温、耐盐、产酸能力强的乳酸菌[16-18]。而纵观以往研究发现，关于杂交构树的研究主要集中在外源添加乳酸菌改善青贮品质和家畜生产性能等方面[1-5,11]，其原料表面附着优势乳酸菌情况尚不明确。因此，本试验以杂交构树青贮为原料，对其附着的乳酸菌进行了分离鉴定，以筛选出适合杂交构树青贮用的优良乳酸菌菌株，为杂交构树专用化菌剂的研发提供基础。

1 材料与方法

1.1 青贮饲料样品

杂交构树(杂交构树‘201’)种植于新疆维吾尔自治区石河子地区143团杂交构树种植示范基地(44°52′ N，85°50′ E；海拔335 m)，待株高长至1.5 m左右，于2020年9月22日利用青饲料收获机全株收割，将原料短切至1～2 cm，采用裹包青贮法调制成青贮，裹包密度500 kg·m-3，裹包规格半径50 cm，高100 cm，裹包膜厚度0.1 mm，裹包层数8～10层，置于18℃～23℃条件下发酵60 d后取样(随机挑选5包中的原料)，进行乳酸菌的分离鉴定。

1.2 乳酸菌的分离与纯化

每包均取制作的青贮20 g，分别装于有180 mL无菌生理盐水的锥形瓶中密封，置于摇床上以120 r·min-1摇动2 h(37℃)，取出后静置。在超净工作台中，用无菌生理盐水进行梯度稀释，取四个适宜梯度(10-5，10-6，10-7，10-8)涂板，每个梯度2个重复，采用涂布平板法，在MRS，M17培养基(含有碳酸钙)中37℃厌氧培养48～72 h。之后，观察菌落形态、大小、颜色、光泽，选择有溶钙圈的典型菌落进行革兰氏染色、油镜镜检及过氧化氢酶触试验。凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的菌株均初步认定为乳酸菌，分别在MRS，M17培养基上以划线的方式(四区划线法)分离纯化培养2～3次。用MRS和M17液体培养基富集(30℃，24 h)，与等体积的甘油混合，封装，—80℃保存备用。

1.3 乳酸菌的鉴定

1.3.1生理生化鉴定 根据菌株的镜检结果可将其初步区分乳酸杆菌和乳酸球菌，将保存备用的乳酸菌菌株活化24 h，参照凌代文[19]和刘慧[20]的方法进行乳酸菌生理生化特性鉴定，以3%的接种量将乳酸菌菌悬液接入MRS，M17液体培养基中，分别在4，10，30，45℃不同温度条件下培养，其中4℃下培养10 d，10℃和30℃下培养3 d，45℃下培养7 d，观察乳酸菌菌株的生长情况。分别在pH值为3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0及含有3.0%和6.5% NaCl的MRS,M17液体培养基中30℃培养48 h，观察乳酸菌菌株的耐酸能力和耐盐能力。采用细菌微量生化鉴定管(由青岛海博生物科技有限公司提供)检测乳酸菌对18种碳源的利用情况。

1.3.2乳酸菌的16S rDNA序列测定 将纯化后的乳酸菌培养液按试剂盒说明提取各菌株DNA，DNA提取试剂盒由北京全式金生物技术有限公司提供。PCR扩增采用细菌通用引物FA-27F：5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGA-TCCTGGCTCAG-3′和RA-1495R：5′-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGGTACCTTGTT-ACGA-3′，反应体系为(50 μL)：DNA模板5 μL，引物27F和1495R(10 μmol·L-1)各1 μL，2×Master Mix 25 μL，ddH2O补足至50 μL。反应程序为：95℃ 10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，30个循环。将PCR扩增产物送往生工生物工程股份有限公司(上海)测序。

1.3.3生长速率和产酸速率测定 将乳酸菌菌悬液以3%的接种量接种于MRS，M17液体培养基中(两种液体培养基的初始pH均调为6.2)，37℃恒温培养24 h。以未加菌悬液的液体培养基为空白对照，每隔2 h取一次样，用紫外可见分光光度计(日立，U-2910)测定各样品的OD600 nm值，以培养时间(h)为横坐标，相对应的吸光值(OD)为纵坐标，绘制成统计图。用酸度计(上海雷磁，PHSJ-3F)测定发酵液pH，根据不同发酵时间(h)对应的发酵液的pH平均值的变化绘制产酸速率曲线。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2018对所有试验数据进行整理，采用Origin 2017软件进行绘图，乳酸菌的16S rDNA序列在GenBank中进行比对，用MEGA 7.0中的Clustal W对最近类群的序列进行多重比较分析，并通过该软件的邻近法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，确定各菌株分类地位[21]。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌菌株的生理生化特性

8株从杂交构树青贮中分离得到的乳酸菌菌株的镜检及生理生化特性分别如图1和表1所示，所有菌株革兰氏染色均为阳性，触酶试验呈阴性。其中G4，G7，G9，G10和G12细胞呈杆状，无芽孢，无运动性，在pH为3.5的条件下能够生长，这些鉴定结果符合乳杆菌(Lactobacillusspp.)的生物学特性。菌株Q3，Q5和Q7细胞在显微镜下呈单、对或成链排列的椭圆形或球形，无芽孢，无运动性，这些鉴定结果符合乳球菌(Lactococcusspp.)的生物学特性。产气试验中菌株G4，G7，G9，Q3，Q5和Q7发酵葡萄糖产酸不产气，为同质型发酵乳酸菌；菌株G10和G12发酵葡萄糖产酸产气，属于异质型发酵乳酸菌。从分离菌株在不同温度的生长情况来看，所有菌株均能够在4℃，10℃，30℃和45℃生长或微弱生长，和其他三个温度条件相比，4℃低温明显抑制了菌株的生长；在不同pH值条件下的生长情况表明，当pH为3.0时，大部分菌株的生长受到抑制，仅菌株Q3，Q5和Q7能在pH为3.0的条件下生长，菌株G4在pH为3.0和3.5的条件下不生长，其它菌株能在pH3.5～pH9.0范围内生长或微弱生长；所有菌株在3%和6.5% NaCl条件下生长良好。

图1 乳酸菌革兰氏染色结果Fig.1 The results of gram stain of lactic acid bacteria

表1 乳酸菌的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria

选取18种碳源对分离的8株乳酸菌进行碳源发酵试验，结果见表2，菌株G4，G9除了鼠李糖不能利用以外，其余糖、醇均可利用；菌株G7不能利用棉子糖、鼠李糖和松三糖，其余糖、醇均可利用；菌株G10，G12不能利用鼠李糖、松三糖、海藻糖、甘露醇，乳糖的利用情况为可变反应；菌株Q3，Q5不能利用乳糖、鼠李糖、松三糖和山梨醇，棉子糖的利用情况为可变反应，其余糖、醇均可发酵利用；菌株Q7不能利用鼠李糖、松三糖，乳糖的利用情况为可变反应。

表2 乳酸菌碳源发酵试验Table 2 Carbon source tests for lactic acid bacteria fermentation

2.2 乳酸菌菌株16S rDNA基因序列分析

经BLAST比较鉴定，8株菌与标准菌株的序列相似性均达到了97.5%以上。将每种菌各选部分参考菌株构建系统进化树(图2)，结果表明，G4，G7，G9与植物乳杆菌(L.plantarum)的进化亲缘度为100%，G10，G12与短乳杆菌(L.brevis)的进化亲缘度为99%，Q3，Q5与屎肠球菌(E.faecium)的进化亲缘度为100%，Q7与戊糖片球菌(P.pentosaceus)的进化亲缘度为100%。依据16S rDNA基因序列的同源性分析，确定G4，G7，G9为植物乳杆菌(L.plantarum)，G10，G12为短乳杆菌(L.brevis)，Q3，Q5为屎肠球菌(E.faecium)，Q7为戊糖片球菌(P.pentosaceus)，G4，G7，G9，G10，G12，Q3，Q5，Q7在Genbank中的登录号为MZ008357—MZ008364。用于构建系统发育树的乳酸菌参考菌株见表3。

图2 乳酸菌基于16S rDNA的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the lactic bacterium strains according to 16S rDNA sequences

表3 乳酸菌菌株的16S rDNA基因序列分析结果Table 3 Gene sequence analysis of 16S rDNA of lactobacillus strains

2.3 乳酸菌菌株的产酸速率及生长特性

不同菌株的产酸速率曲线见图3A，除菌株G10外，其余菌株培养液的pH值在24 h之内均能降到4.5以下。其中，G4，G7，G9，G10和G12有相似的产酸速率，0～8 h产酸速率较慢，8～12 h逐渐变快；Q3，Q5和Q7有相似的产酸速率，0～8 h产酸速率较快，8～10 h有回升趋势，10～24 h逐渐变缓。菌株G4，G7和G9产酸能力较强，在培养24 h后pH降至4.01，4.03，4.15；菌株G10产酸能力较弱，在培养24 h后pH降至4.55。

不同菌株的生长速率曲线结果见图3B，由图可知，在培养2 h后菌株Q3，Q5和Q7进入对数生长期，其余菌株约在6 h后进入对数生长期，所有菌株在12 h后进入稳定期，且24 h内未出现迟滞期。各菌株的生长速率与产酸速率基本表现一致，在菌株进入生长期时产酸速率会上升，稳定期时产酸速率则趋于平缓。

图3 乳酸菌菌株的产酸速率及生长速率Fig.3 Acid production rate and growth rate of lactic acid bacteria strains

3 讨论

研究表明，植物表面附生乳酸菌更能适应植物生存环境，因此，从植物原料发酵过程中分离筛选青贮用优良乳酸菌是最为简单、高效和快捷的方法[22]。由于传统的微生物鉴定法较为复杂，对于界限模糊的相似菌株，鉴定结果可能会不准确，而微生物分子生物学鉴定方法能够弥补这些缺点，客观、方便、高效的解决许多菌种的分类问题，因而研究中通常使用传统的生理生化鉴定法结合微生物分子生物学法来对分离的细菌进行综合鉴定[23-24]。本研究从杂交构树青贮中分离得到8株乳酸菌，通过16S rDNA基因序列分析表明，G4，G7，G9为植物乳杆菌，G10，G12为短乳杆菌，Q3，Q5为屎肠球菌，Q7为戊糖片球菌。研究表明，植物乳杆菌模式株能够发酵鼠李糖以外的所有糖[19]，这与本研究所分离的菌株G4，G9的发酵特性一致，而菌株G7除不能利用棉子糖、鼠李糖和松三糖，其余糖、醇均能利用；短乳杆菌模式株不能发酵纤维二糖、松三糖、甘露糖、鼠李糖、海藻糖、甘露醇和山梨醇[19]，本研究分离出的菌株G10,G12能够利用纤维二糖、甘露糖、山梨醇，与模式株有一定差异；菌株Q3，Q5不能发酵利用鼠李糖、松三糖和棉子糖[19]，其余糖、醇均能利用，这与屎肠球菌模式株的结果一致；戊糖片球菌模式株不能利用蔗糖、鼠李糖、山梨醇[19]，而本研究分离的菌株Q7可以利用蔗糖、山梨醇，与模式株有差异，这可能是由于同一属种的乳酸菌对同一种糖的发酵能力存在差异。目前，用于乳酸菌种属鉴定的生理生化标准较模糊[25]，因此糖发酵能力只能作为一种参考，应用分子生物学方法与传统方法结合来鉴定乳酸菌更为准确[26]。

产酸和生长速率是用以衡量相同条件下菌种利用资源发酵能力的参数，也是筛选优良乳酸菌菌株的重要指标[27]。本研究中所有乳酸菌在发酵过程中迟滞期不明显，说明其在培养液中生长繁殖速度快，可使乳酸菌数量迅速增多，增强发酵，迅速降低pH值[28]。其中菌株G4,G7和G9生长速率和产酸能力更强，理论上可用于促进青贮饲料中乳酸发酵，而其在功能上是否与其它饲草源分离的植物乳杆菌有所差异还有待继续研究。以往研究表明，用作青贮菌剂的微生物应具有均一发酵途径，可广泛利用各种可溶性碳水化合物产生大量的乳酸，能适应较大的温度范围，耐酸能力强，能快速降低pH值(至少使pH值最终达4.0)，从而能够抑制其他有害微生物生长[29-30]。本研究中，所有菌株均能够在4℃～45℃,3%和6.5% NaCl浓度下生长；仅有菌株Q3,Q5和Q7在pH为3的条件下能生长，其余菌株能在pH3.5～9.0范围内生长或微弱生长，体现出较强的耐酸、耐盐能力及较广的温度适应范围。

青贮发酵过程中，适温条件下乳杆菌的活力及生长速度均优于乳球菌[15]，且乳杆菌更易于分离，因此乳酸菌青贮添加剂菌种首选植物乳杆菌[31]；而由于实际生产中单独添加某一种乳酸菌并不能达到最佳的青贮效果，因此通常将植物乳杆菌和其他菌种复合添加作为青贮乳酸菌制剂，其中肠球菌(Enterococcusspp.)、片球菌(Pediococcusspp.)等同质型乳酸菌在发酵初期繁殖旺盛，往往作为发酵的启动乳酸菌，广泛用于与植物乳杆菌一起构成复合青贮添加剂[28-32]，在发酵初期创造良好的酸性环境，从而为乳酸菌的生长提供有利条件。国内外常见的青贮乳酸菌添加剂是将植物乳杆菌与乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)复合添加[22，33]；亦或是植物乳杆菌与粪链球菌(Streptococcusfaecalis)的混合接种[34-35]，这些乳酸菌制剂在实际应用中明显改善了青贮品质。同时，诸多研究也证实，将植物乳杆菌等同质型乳酸菌与异质型乳酸菌联合接种不仅可改善青贮品质，且可有效提高青贮有氧稳定性，减少二次发酵[6-7]。本试验筛出的乳酸菌均为青贮用常见菌种，对于各菌株之间如何配伍及其应用效果，以及它们之间有无相互促进或拮抗的作用，能否为提高杂交构树青贮品质提供乳酸菌资源，还需要在后续试验中进一步研究。

4 结论

综上所述，本研究从杂交构树青贮中分离得到8株乳酸菌，均具有较强的耐酸、耐盐能力及较广的温度适应范围，以及广泛的发酵碳源特征。经16S rDNA序列分析，3株为植物乳杆菌，2株为短乳杆菌，2株为屎肠球菌，1株为戊糖片球菌，其中，3株植物乳杆菌的产酸能力最强，生长速率最快，可作为制备杂交构树青贮的饲料添加剂。