藏北高寒草地土壤真菌群落系统发育多样性对放牧的响应

张豪睿， 付 刚

(1.中国科学院地理科学与资源研究所生态系统网络观测与模拟重点实验室拉萨高原生态系统研究站， 北京 100101；2.中国科学院大学， 北京 100049)

生物多样性包括物种多样性和系统发育多样性等，是人类可持续发展的重要基础[1]。土壤真菌作为与植物多样性和生产力密切相关的土壤微生物，对调控植物多样性和生产力有着十分重要的影响[2-3]。土壤真菌多样性作为衡量土壤生态状况的重要生物指标，不仅能够反映陆地生态系统质量，而且可以对环境胁迫做出快速反应[4]。草地作为一种非常重要的陆地生态系统，放牧是其最重要的人类利用方式之一。因此，量化草地生态系统土壤真菌多样性对放牧的响应规律对于草地生态系统放牧优化管理和生物多样性保护等都非常重要。

青藏高原作为“世界第三极”，对气候变化和人类活动的干扰尤为敏感[5]。青藏高原是欧亚大陆最大的草原单元，面积约为250万平方公里，且孕育了多种不同类型的高寒草地，如高寒草甸和高寒草原化草甸等[6-7]。青藏高原丰富的草地资源使得放牧成为青藏高原高寒草地最重要的土地利用方式[8]。由于气候条件和土壤条件等原因，青藏高原上形成了多种不同方式的放牧活动，如冷季放牧和暖季放牧等，从而形成了冷季牧场和暖季牧场等的区分。放牧活动将持续影响青藏高原草地生态环境及其生态系统服务功能，从而对野生动物保护(尤其是珍稀濒危野生动物)和人类健康发展等产生重要影响。放牧不仅可以通过牲畜踩踏草地，改变高寒草地的土壤紧实度、透气性和持水能力等物理性质[9]，而且放牧所产生的牲畜粪便可以改变土壤的营养成分等化学性质[10]。放牧造成的土壤理化性质的变化则可以影响土壤真菌多样性。有关放牧对青藏高原高寒草地的土壤真菌多样性影响的研究已经开展。然而目前的研究并未得到一致的结论，如Che等[11]在青藏高原的放牧试验研究表明，放牧没有显著改变土壤真菌群落α多样性和群落组成。Yang等[12]在青藏高原一个高寒草甸的放牧试验研究则表明冷季放牧和全年放牧均未显著改变土壤真菌群落α多样性，却都改变了土壤真菌群落结构。此外，前人的研究主要关注土壤真菌群落物种多样性，而对土壤真菌群落系统发育多样性的研究较少。然而仅分析物种或系统发育多样性不能完全解决生理限制、生物相互作用、地理障碍和进化过程如何相互影响当地群落结构的问题[13-15]。群落系统发育结构模式不仅反映了基于生态位的过程，如竞争和栖息地过滤，还反映了物种进化、生态差异和生物地理过程[16-18]。

因此，放牧是否会影响青藏高原高寒草地土壤真菌群落系统发育多样性以及是否会改变土壤真菌群落系统发育多样性沿海拔的分布格局有待进一步研究；放牧对青藏高原高寒草地土壤真菌群落系统发育多样性的影响是否与放牧季节和草地类型有关也有待于进一步研究。基于此，本研究依托2008年在藏北高原当雄县设置的3块配对的围栏和自由放牧地，进行以下研究，(1)比较了冷季放牧和暖季放牧对土壤真菌群落系统发育多样性的影响差异；(2)高寒草原化草甸和高寒草甸的土壤真菌群落系统发育多样性对暖季放牧的响应差异；(3)对比分析了对照和放牧条件下的土壤真菌群落系统发育多样性的海拔分布格局的差异。本研究的开展能够为全球变化背景下的青藏高原土壤微生物多样性保护和高寒草地生态系统优化放牧管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域和试验设计

研究区域位于西藏自治区拉萨市当雄县。放牧是藏北高原重要的土地利用方式，为量化放牧对藏北高寒草地生态系统的影响，2008年设置了3个配对的围栏和自由放牧试验样地(图1)，每个围栏样地约为20 m × 20 m。三块样地分别位于4 313 m(30°30′ N,91°04′ E),4 513 m(30°31′ N,91°04′E)和4 693 m(30°32′ N,91°03′ E)。这3个样地包括冷季放牧的高寒草原化草甸(Alpine steppe meadow for winter pasture,ASMWP)、暖季放牧的高寒草原化草甸(Alpine steppe meadow for summer pasture,ASMSP)和暖季放牧的高寒草甸(Alpine meadow for summer pasture,AMSP)。围栏内为封育样地，禁止放牧。围栏外为自由放牧样地，放牧牲畜主要为牛羊等。ASMWP和ASMSP样地的优势物种分别为小嵩草(Kobresiapygmaean)、黒褐苔草(Carexatrofusca)和丝颖针茅(Stipacapillacea)，而AMSP样地的优势种为小嵩草。三个样地的土壤质地均为砂壤土，属于高寒草甸土。在0～30 cm土壤深度内，ASMWP、ASMSP和AMSP的土壤全氮和有机碳分别为2.1 g·kg-1和19.8 g·kg-1，2.2 g·kg-1和24.0 g·kg-1，3.3 g·kg-1和43.7 g·kg-1[19]。为了方便、简洁的表述两个样地间的群落周转关系，我们利用“CC”来表示两个对照样地间的系统发育距离，C3C5代表对照条件下ASMWP和ASMSP间的系统发育距离；C3C7代表对照条件下ASMWP和AMSP间的系统发育距离；C5C7代表对照条件下ASMSP和AMSP间的系统发育距离。利用“GG”表示两个放牧样地间的系统发育距离，G3G5代表放牧条件下ASMWP和ASMSP间的系统发育距离；G3G7代表放牧条件下ASMWP和AMSP间的系统发育距离；G5G7代表放牧条件下ASMSP和AMSP间的系统发育距离。C3G3,C5G5以及C7G7分别表示高寒草原化草甸冷季牧场、高寒草原化草甸暖季牧场和高寒草甸暖季牧场的围栏和放牧处理间的系统发育距离。C_ASMWP和G_ASMWP分别表示围栏和冷季放牧处理下的高寒草原化草甸样地；C_ASMSP和G_ASMSP分别表示围栏和暖季放牧处理下的高寒草原化草甸样地；C_AMSP和G_AMSP则分别表示围栏和暖季放牧处理下的高寒草甸样地。

图1 放牧样地示意图Fig.1 Schematic diagram of grazing plots注：ASMWP,冷季放牧的高寒草原化草甸;ASMSP,暖季放牧的高寒草原化草甸;AMSP,暖季放牧的高寒草甸Note：ASMWP,alpine steppe meadow for winter grazing;ASMSP,alpine steppe meadow for summer pasture;AMSP,alpine meadow for summer pasture

1.2 土壤样品的采集和分析

在2018年8月，在每个海拔的围栏外(自由放牧样地)和围栏内(围栏封育样地)各选取4个样方(50 cm×50 cm)。在每个样方内，使用直径为3.7 cm的土钻收集表层土壤(0～10 cm)。在每个重复样方内采集3钻土样充分混匀后作为一个重复样本。4个重复样本不进行混合。一部分土壤样品立即放入液氮中，带回实验室放置在-80℃的冰箱里保存，用于土壤微生物的测试分析。将其余的土壤样品放置在-20℃的冰箱里保存，用于土壤常规理化性质(土壤含水量、铵态氮、硝态氮、速效磷和pH值)的观测，其中土壤含水量采用烘干法观测，铵态氮和硝态氮采用流动分析仪观测[20]。

土壤真菌群落采用高通量测序，测序公司为广州赛哲生物科技股份有限公司。样品使用QIAGEN(Dusseldorf,Germany)试剂盒提取并纯化DNA。用ITS1F和ITS2R引物扩增土壤真菌群落的ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3′)。PCR反应体系为20 μL。PCR反应扩增条件为:98℃预变性1分钟；27个循环进行聚合酶链反应扩增；最后一次扩增为72℃条件下10 分钟。获得的PCR产物送往Illumina HiSeq 2500平台进行测序。详细的DNA提取方法以及生物信息学分析详见[7]。筛选OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs代表序列。用RDP Classifier方法与UNITE数据库对土壤真菌OTUs代表序列进行物种注释分析[17]。

1.3 统计分析

系统发育多样性(Phylogenetic diversity，PD)、平均进化距离(Mean pairwise distance，MPD)以及平均最近分类距离(Mean nearest taxon distance，MNTD)分别由“picante”包的“PD”、“MPD”和“MNTD”计算得到(https://github.com/skembel/picante)。βMNTD是两个不同群落中的最近亲属间的丰度加权平均系统发育距离，本研究中使用“iCAMP”包的“bmntd.big”函数得到。使用“vegan”包的“adonis2”函数进行多元置换方差分析(Permutational multivariate analysis，PARMANOVA)统计分析，以检验放牧和对照处理间的βMNTD的显著性(https://github.com/vegandevs/vegan/)。使用“vegan”包的“monoMDS”函数对βMNTD进行非计量多维标度(Nonmetric multidimensional scale analysis,NMDS)分析(https://github.com/vegandevs/vegan/)。采用T检验统计分析了每个样地间放牧处理和对照处理的PD,MPD以及MNTD的差异。对每两个样地间的环境因子的欧氏距离也进行了样本T检验。通过单因素方差分析(One-way ANOVA)检验了海拔对PD,MPD以及MNTD的影响。所有的绘图以及统计分析均在R.4.0.2软件中实现。

2 结果与分析

2.1 放牧对土壤真菌群落系统发育α多样性的影响

对照处理的PD,MPD以及MNTD在三个海拔间没有显著差异，放牧处理间也不存在显著性差异(表1)。放牧处理并没有显著改变ASMWP,ASMSP以及AMSP的土壤真菌群落系统发育α多样性(图2)。

表1 三海拔间的土壤真菌群落系统发育α多样性的方差分析Table 1 Variance analysis of phylogenetic α diversity of soil fungal community among three altitudes

2.2 对照和放牧处理间的土壤真菌群落βMNTD

对土壤真菌βMNTD进行NMDS和adonis分析发现，C_ASMWP与G_ASMWP,C_ASMSP与G_ASMSP,C_AMSP与G_AMSP之间在图中明显分开，P值均小于0.05(图3a，表2)。多重比较的结果表明对照和放牧处理间的BMNTD在三个海拔间没有显著性差异(图3b)。土壤速效磷、速效氮磷比和土壤铵态氮是影响对照和放牧间的βMNTD值的重要环境因子(图4)。

图3 (a)土壤真菌系统发育β多样性的非度量多维尺度分析，(b)三个海拔放牧和对照处理间的系统发育距离Fig.3 (a) Non-metric multidimensional scaling analysis for β-diversity of soil fungal community;(b) Phylogenetic distance between grazing and control treatments at three altitudes注：ASMWP,冷季放牧的高寒草原化草甸;ASMSP,暖季放牧的高寒草原化草甸;AMSP,暖季放牧的高寒草甸;C为对照处理，G为放牧处理Note：ASMWP,alpine steppe meadow for winter pasture;ASMSP,alpine steppe meadow for summer pasture;AMSP,alpine meadow for summer pasture;C,the control treatment and G,the grazing treatment

表2 基于βMNTD距离的Adonis检验Table 2 Adonis test based on βMNTD distance

2.3 放牧对土壤环境因子的海拔分布格局的影响

放牧后，ASMWP与ASMSP样地间土壤含水量和硝态氮的差异减少，而速效磷的差异增加；ASMWP与AMSP样地间土壤含水量、铵态氮、pH值以及速效氮磷比增加，而土壤硝态氮的差异减少；ASMSP与AMSP样地间铵态氮及速效氮磷比增加，而土壤硝态氮的差异减少(图5)。

2.4 放牧对土壤真菌群落系统发育β多样性的海拔分布格局的影响

放牧导致了ASMWP与ASMSP样地间的βMNTD的显著降低，但是放牧和对照处理下ASMWP与AMSP以及ASMSP与AMSP样地间的βMNTD未发生显著变化(图6)。对照处理下两个海拔间(C3C5，C3C7以及C5C7)的土壤真菌β多样性以及放牧处理间两个海拔间(G3G5，G3G7以及G5G7)的土壤真菌β多样性与环境因子的ABT分析结果表明，对照处理下土壤真菌β多样性与速效氮磷比(20.3%)、铵态氮(19.5%)以及土壤含水量(17.0%)的距离矩阵相关性较大；放牧处理下土壤真菌β多样性与土壤含水量(37.5%)、硝态氮(16.3%)以及速效氮磷比(13.6%)的距离矩阵相关性较大(图4)。

图4 基于Aggregated boosted tree(ABT)分析的土壤真菌系统发育β多样性与环境因子(两个样地间的基于欧式距离的距离矩阵)的关系Fig.4 Environmental drivers of phylogenetic β-diversity of soil fungal community composition according to the Aggregated boosted tree (ABT) analysis注：AP，速效磷；铵态氮；硝态氮；SM，土壤含水量；速效N∶P，(铵态氮+硝态氮)/速效磷。(a)为C3G3,C5G5以及C7G7之间的βMNTD与环境因子的关系，(b)为C3C5,C3C7以及C5C7之间的βMNTD与环境因子的关系，(c)为G3G5，G3G7以及G5G7之间的βMNTD与环境因子的关系Note:AP，available nitrogen;SM，soil moisture;Available N∶P,(ammonium nitrogen + nitrate nitrogen)/available P.(a) the relationship between β-MNTD and environmental factors among C3G3,C5G5 and C7G7,(b) the relationship between β-MNTD and environmental factors among C3C5,C3C7 and C5C7,and (c) the relationship between β-MNTD and environmental factors among G3G5,G3G7 and G5G7

图5 放牧和对照处理下样地间环境因子的欧氏距离Fig.5 Euclidean distance of environmental factors between plots under grazing and control treatments注：CC为两个对照样地之间，GG为两个放牧样地之间。*为P <0.05，**为P <0.01，***为P <0.001，ns为P >0.05Note:CC between two control plots,GG between two grazing plots. * is P <0.05,** is P <0.01,*** is P <0.001,ns is P>0.05

图6 放牧以及对照处理下两个海拔间的土壤真菌群落βMNTDFig.6 βMNTD of soil fungal community between two sites under grazing and control treatment注：CC为两个对照样地之间的βMNTD，GG为两个放牧样地之间的βMNTDNote:CC is βMNTD between two control plots,GG is βMNTD between two grazing plots

3 讨论

3.1 冷季放牧和暖季放牧对土壤真菌群落系统发育多样性的影响

冷季放牧和暖季放牧均未显著改变土壤真菌群落系统发育α多样性,与Zhang等[7]的研究一致，说明土壤真菌群落系统发育和物种α多样性对冷季放牧和暖季放牧可能都不敏感。

虽然冷季放牧和暖季放牧都显著改变了土壤真菌群落系统发育结构，但是它们的调控机制并不相同：冷季放牧所导致的土壤铵态氮、速效氮磷比和土壤含水量的变化可能是导致高寒草原化草甸土壤真菌群落系统发育结构变化的重要原因，而暖季放牧所导致的土壤硝态氮的变化可能是导致高寒草原化草甸土壤真菌群落系统发育结构变化的重要原因。我们之前的研究[7]表明，冷季放牧主要通过改变属于土壤真菌子囊菌门和担子菌门的某些关键种的相对丰度影响高寒草原化草甸土壤真菌群落物种组成，而暖季放牧却主要通过改变担子菌门的某些关键种的相对丰度影响高寒草原化草甸土壤真菌群落物种组成。因此，虽然冷季放牧和暖季放牧对高寒草原化草甸土壤真菌群落系统发育结构的影响强度没有显著差异(图3)，但是冷季放牧对高寒草原化草甸土壤真菌群落系统发育结构的影响可能主要与子囊菌门和担子菌门的系统发育信息的变化有关，而暖季放牧对高寒草原化草甸土壤真菌系统发育结构的影响则主要与担子菌门的系统发育信息的变化有关。这与Shi等[21]的研究结果并不一致，他们发现冷季刈割改变了丛枝菌根真菌群落系统发育α多样性，但并未改变丛枝菌根真菌群落系统发育β多样性。这可能是由于冷季刈割模拟冷季放牧只模拟了牛羊对牧草的啃食，而并未考虑牲畜的踩踏对土壤物理性质的改变和牲畜粪便对土壤化学性质的影响[22-26]。

3.2 不同类型高寒草地土壤真菌系统发育多样性对放牧的响应

本研究发现暖季放牧对高寒草原化草甸和高寒草甸的土壤真菌系统发育α多样性都无显著影响，这与Zhang等[7]的研究一致，表明高寒草甸和高寒草原化草甸的土壤真菌群落系统发育和物种α多样性对暖季放牧的响应可能都不敏感。

我们之前的研究表明暖季放牧引起的高寒草原化草甸的土壤真菌群落的物种组成的变化主要是由于担子菌门的变化造成的，而暖季放牧引起的高寒草甸的土壤真菌群落的物种组成的变化则主要与子囊菌门的变化有关[7]。因此，虽然暖季放牧导致的高寒草原化草甸的土壤真菌群落系统发育结构的变化与暖季放牧导致的高寒草甸的土壤真菌群落系统发育结构的变化没有显著差异，但是这并不表明暖季放牧导致的两种类型高寒草地的土壤真菌群落系统发育结构的变化是完全相同的：暖季放牧导致的高寒草原化草甸的土壤真菌群落的系统发育结构的变化可能主要与担子菌门的系统发育结构有关，而暖季放牧导致的高寒草甸的土壤真菌群落的系统发育结构的变化则可能主要与子囊菌门的系统发育结构的变化有关。暖季放牧增加了高寒草甸的土壤铵态氮含量，而减少了高寒草原化草甸的土壤硝态氮含量[7]。因此，暖季放牧导致的高寒草原化草甸和高寒草甸的土壤真菌群落系统发育结构的变化与暖季放牧导致的高寒草原化草甸和高寒草甸的土壤速效氮的不同变化有关。

3.3 放牧改变了土壤真菌群落系统发育β多样性的海拔分布格局

ASMWP和ASMSP样地间的βMNTD由于不同季节放牧的影响而显著降低，即放牧使得两个海拔间的土壤真菌群落的系统发育结构变得更相似。这可能与对照和放牧处理下土壤真菌群落系统发育β多样性的环境调控因子不同有关：对照条件下土壤速效氮磷比、铵态氮以及土壤含水量与土壤真菌群落系统发育β多样性的相关性较大，而放牧条件下土壤含水量成为影响土壤真菌群落系统发育β多样性的主导因子，且放牧使得两个海拔间的土壤含水量变得更为相似(欧氏距离减少49.1%)。因此，放牧引起的土壤含水量的相似性的增加是造成两个海拔间系统发育结构变得更相似的重要原因。

4 结论

本研究依托藏北高原的三个配对的自由放牧和围栏试验样地发现：放牧均没有显著改变ASMWP,ASMSP和AMSP的土壤真菌群落系统发育α多样性；放牧均显著改变了ASMWP，ASMSP和AMSP的土壤真菌群落系统发育结构，但放牧对土壤真菌群落系统发育结构的影响并不完全一致；放牧改变了土壤真菌群落系统发育β多样性的海拔分布格局。