蓟马取食对苜蓿氨基酸组成及含量的影响

武杰瑞， 刘秉毅， 特木尔布和, 爽 爽, 代 蕊, 张志强

(内蒙古农业大学草原与资源环境学院， 内蒙古 呼和浩特 010000)

苜蓿(MedicagosativaL.)具有高产优质、适应性强等特点，是我国草牧业发展的重要物质基础。随着国家“振兴奶业苜蓿发展行动”计划的实施及“粮改饲”政策的推动下，我国苜蓿种植面积逐年增加。然而，在生产栽培过程中，虫害严重影响苜蓿产量和品质。目前我国已报道的苜蓿害虫共计297种，分属于8个目的48个科[1]，蓟马已经成为苜蓿生产的主要害虫之一[2-3]。蓟马以特有的锉吸式口器通过锉破植物表皮，吸吮汁液导致植株枯萎，同时还传播包括番茄斑萎病毒在内的多种病毒[4]。据报道，每年能造成高达30%苜蓿草产量损失[5]。因此,开展苜蓿抗蓟马机理研究具有重要的经济意义与生态意义。

为抵抗昆虫的危害，植物在长期进化过程中形成了复杂的防御体系，包括组成型防御和诱导型防御[6]。诱导型防御是指植物在遭受病虫危害后形成的防御机制，组成型防御体系分为物理防御和化学防御，化学防御是指植物利用自身的一些化学物质使昆虫趋避、拒食、中毒和生长发育受抑制的防御措施。这些化学物质主要有两类，一类是核酸、蛋白质、氨基酸、脂类等营养物质，另一类主要是植物的次生代谢物。研究表明，植物次生物质如生物碱、酮类、单宁类、萜类、黄酮类、有机酸等是植物抗虫性的重要组成部分[7]，但这些生化因子有时会对植物的产量和营养品质产生影响。营养物质诸如氨基酸、磷脂、脂肪酸、类固醇和抗坏血酸也会不同程度的影响植物的抗虫性[8-9]。一些必须氨基酸对昆虫的生长发育和生命过程至关重要，昆虫需要通过从植物中摄取这些氨基酸来维持自身的生长发育需要。在长期的协同进化过程中，植物也形成了通过调节自身氨基酸含量和组成来抵御虫害的能力。研究表明，具有抗病虫害能力的植物通常含有较高水平的酚类化合物和较低水平的氨基酸[10]。此外，氨基酸组成的不同，也会影响植物的抗虫性。水稻(OryzasativaL.)茎秆中赖氨酸、精氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的含量高低与稻螟虫生长呈正相关，谷氨酸、苏氨酸含量高低与稻螟虫生长呈负相关[11]。不同品系的杨树(PopulusL.)木质部中丙氨酸、精氨酸、谷氨酸等氨基酸相对含量越高，青杨脊虎天牛(Xylotrchusrusticus)危害越严重[12]。然而，有关氨基酸含量及组成对于不同昆虫与植物之间的相关研究依然较少。

特木尔布和等[13]研究发现，‘草原2号’苜蓿(MedicagovariaMartin.‘Caoyuan No.2’)的虫情指数为0.901，为害点系数为0.61；‘草原4号’苜蓿(MedicagosativaL.‘Caoyuan No.4’)的虫情指数仅为0.334，为害点系数为0.26，当虫情指数低于0.5时表明品种为抗虫品种。因此本研究以‘草原2号’感蓟马品种和‘草原4号’抗蓟马品种为材料，分别进行牛角花齿蓟马(Odontothripsloti)接虫和不接虫处理，分析不同处理后苜蓿叶片中氨基酸和氨基酸衍生物的种类及含量变化，探究不同氨基酸及氨基酸衍生物与苜蓿抗蓟马机制的关系，为蓟马防治及抗蓟马育种提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验设计

供试苜蓿材料为‘草原2号’(MedicagovariaMartin.‘Caoyuan No.2’)和‘草原4号’苜蓿(MedicagosativaL.‘Caoyuan No.4’)，供试虫源为实验室饲养的牛角花齿蓟马(Odontothripsloti)成虫。在人工气候室种植‘草原2号’和‘草原4号’苜蓿各20盆，每盆3株，昼夜平均气温分别控制在(30±5)℃，(20±5)℃，昼夜相对湿度控制在(55±5)%，(70±5)%，保证所有材料生长环境一致。待苜蓿生长60 d后，接入牛角花齿蓟马成虫，每盆50头，并用防虫网罩住。分别记为：‘草原2号’接虫(2-T)、‘草原4号’接虫(4-T)，‘草原2号’未接虫(2-CK)和‘草原4号’未接虫(4-CK)。接虫7 d后，取供试苜蓿材料倒四叶，测定氨基酸含量及氨基酸衍生物，3次重复。

1.2 试验方法

1.2.1氨基酸含量测定 采用氨基酸分析仪(L8900，日本日立公司)测定样品中的氨基酸含量。将苜蓿叶片烘干粉碎，准确称取0.1 g(精确至0.0001 g),将称量好的样品置于水解管中，在水解管中先加入10 mL 6 mol·L-1的盐酸溶液，再加入苯酚3滴，将水解管放入冷冻剂中冷冻3～5 min，然后对水解管重复抽真空充氮气3次后密封，将已封口的水解管放在110℃电热鼓风恒温箱内，水解22 h，冷却，过滤后定容至50 mL。准确吸取1.0 mL滤液于试管中，用平行蒸发仪在45℃加热条件下减压干燥，蒸干后加入2.0 mL pH值2.2柠檬酸钠缓冲液，震荡混匀，0.22 μm滤膜过滤，作样品测定液，供仪器测定使用，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸浓度。色谱条件：柱温57℃；茚三酮流速0.4 mL·min-1；缓冲液流速：0.4 mL·min-1；进样量：20 μL[14-16]。

1.2.2氨基酸衍生物含量测定 采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪(1290/6460，美国Agilent公司)测定样品中的氨基酸衍生物含量。色谱条件：色谱柱为Waters HILIC柱(3 μm,2.1×100 mm)，流动相为0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，流速为400 μL·min-1，梯度洗脱条件为0～10 min A相从5%梯度升至95%并保持4～14 min，柱温30℃，进样量为2 μL。质谱条件为：ESI电喷雾离子源，扫描方式为多反应监测模式，干燥气流速8 L·min-1，干燥器温度350℃，鞘气流速10 L·min-1，鞘气温度350℃，锥孔电压25 Psi，毛细管电压3 500 V[17-18]。

1.3 数据统计

氨基酸分析仪测试数据由仪器自带的EZChrom Elite软件进行数据统计。液质联用方法测试数据由仪器自带的Mass Hunter定性和定量软件进行数据统计。采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，利用单因素方差分析(P<0.05)比较不同处理的氨基酸含量差异。

2 结果与分析

2.1 接种蓟马后两种苜蓿氨基酸含量分析

通过氨基酸分析仪测定了样品中17种氨基酸的含量。如图1所示，2-CK,4-CK和2-T,4-T的氨基酸总含量不存在显著差异，但在受到蓟马为害后，和对照组相比，2种苜蓿的氨基酸总含量都显著下降(P<0.05)，2-T氨基酸总含量下降29.67%，4-T氨基酸总含量下降44.28%。

图1 牛角花齿蓟马为害7 d后苜蓿氨基酸总含量Fig.1 Total amino acid content of alfalfa damaged by Odontothrips loti after 7 days注：不同字母表示所有处理间差异显著(P<0.05)。下图同Note:Different letters indicate significant difference at the 0.05 level. The same as below

在未受蓟马为害时，4-CK天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸和酪氨酸(图2a,2b,2c,2 d)含量都显著高于2-CK(P<0.05)，二者含量差异最大的是谷氨酸,4-CK谷氨酸含量比2-CK高38.79%；而苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和精氨酸含量则显著低于2-CK(P<0.05)(图2e,2f,2 g,2 h,2i)，二者含量差异最大的是苏氨酸，4-CK苏氨酸含量比2-CK低27.89%。

在蓟马为害后，与对照组相比，4-T半胱氨酸(图3 h)含量显著上升(P<0.05),升高了41.55%；天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸(图2a,2b,2c,2e,2j,2l)含量显著下降(P<0.05)，其中降低最多的是谷氨酸，达到了57.95%。2-T酪氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和丙氨酸(图2d,2m,2n,2o)含量显著上升(P<0.05),其中升高最多的是丙氨酸，达到了73.16%；天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、苏氨酸、组氨酸、精氨酸和缬氨酸(图2a,2b,2c,2e,2 h,2i,2j)含量显著下降(P<0.05)，其中降低最多的是谷氨酸，达到了46.65%。

含硫氨基酸在植物逆境抗性方面发挥着重要作用，在蓟马为害后，与对照组相比，2-T蛋氨酸(图2 m)含量升高73.16%，半胱氨酸(图2q)含量无显著差异；而4-T蛋氨酸含量升高36.11%，半胱氨酸含量升高41.55%。

图2 牛角花齿蓟马为害7 d后苜蓿17种氨基酸的含量Fig.2 Content of 17 amino acids in alfalfa damaged by Odontothrips loti for 7 days

2.2 不同处理的紫花苜蓿氨基酸衍生物含量分析

通过超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪在样品中测得了93种氨基酸及其衍生物。未受到蓟马为害时，与2-CK相比，4-CK产生了11种差异氨基酸衍生物。4-CK中有6种氨基酸衍生物含量显著高于2-CK，主要为L-半胱氨酸、S-腺苷蛋氨酸、L-高半胱氨酸等含硫氨基酸及左旋肌肽；有5种氨基酸衍生物含量显著低于2-CK(P<0.05)，主要包括苯乙酰甘氨酸和N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺(表1)。

表1 未受蓟马为害苜蓿差异氨基酸衍生物的含量Table 1 Content of different amino acid derivatives in health alfalfa

与2-CK相比，2-T产生了23种差异氨基酸衍生物，其中17种氨基酸衍生物显著下调，6种氨基酸衍生物显著上调(P<0.05)。下调氨基酸衍生物主要为L-丙氨酸、L-天冬氨酸等营养物质及谷胱甘肽还原型，上调氨基酸衍生物主要为L-半胱氨酸、L-高半胱氨酸、左旋肌肽、苯乙酰甘氨酸和N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺等含硫或苯环的氨基酸(表2)。

表2 牛角花齿蓟马为害7 d后‘草原2号’苜蓿差异氨基酸衍生物的含量Table 2 Different amino acid derivatives content of ‘Caoyuan No.2’ alfalfa damaged by Odontothrips loti for 7 days

与4-CK相比，4-T产生了7种差异氨基酸衍生物，其中5种氨基酸衍生物显著下调，2种氨基酸衍生物显著上调(P<0.05)。下调氨基酸衍生物主要包括谷胱甘肽还原型、氧化谷胱甘肽、S-甲基谷胱甘肽等谷胱甘肽代谢通路相关氨基酸及其衍生物，上调氨基酸及其衍生物主要为苯乙酰甘氨酸和N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺2个含苯环氨基酸(表3)。

表3 牛角花齿蓟马为害7 d后‘草原4号’苜蓿差异氨基酸衍生物的含量Table 3 Different amino acid derivatives content of ‘Caoyuan No.4’ alfalfa damaged by Odontothrips loti for 7 days

3 讨论

植物在长期的进化过程中对昆虫、病原菌以及植食性动物取食形成了多种防御机制，植物抗虫防御机制的解析对于抗虫品种选育和害虫的综合防治具有重要的理论意义。通过加性遗传方差分析发现，植物对蓟马的抗性是可遗传的[19]，这种遗传效应包括植物的物理防御和化学防御。当苜蓿受到蓟马为害时，苜蓿中的蛋白质、胡萝卜素等营养物质含量下降，总酚、单宁、木质素等含量均升高[20-21]。

植物组织中的氨基酸为植食性昆虫生长发育提供必不可少的营养物质。本试验中，在蓟马为害后，‘草原2号’和‘草原4号’的氨基酸总含量都显著下降(P<0.05)，可能是由于蓟马取食苜蓿叶片降低了苜蓿叶片中营养物质含量，导致氨基酸总量降低。研究表明，植物在受到病虫害胁迫时，抗病虫能力强的植物品种通常氨基酸总含量较低，低浓度氨基酸会抑制昆虫的生长发育[22]，‘草原4号’在蓟马取食后具有更低氨基酸含量，推测与其较强的抗蓟马性有关。

研究发现，高浓度的天冬氨酸和谷氨酸可以导致桃蚜(Myzuspersicae)和烟粉虱(Bemisiatabaci)死亡率到达94%以上[23]。本试验结果表明，在未受蓟马为害时，‘草原4号’天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸和酪氨酸含量都显著高于‘草原2号’(P<0.05)；在蓟马为害后，‘草原2号’和‘草原4号’的天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸和缬氨酸含量都显著下降(P<0.05)。据此推测，抗蓟马品种‘草原4号’叶片中高含量的天冬氨酸和谷氨酸可能不利于蓟马的生长发育，进而提高了其抗虫性。

刘旭明等[24]研究发现，棉花(Gossypiumspp.)在受到蚜虫(Aphidoidea)的胁迫时，棉株中脯氨酸含量大幅升高，从而提高棉花对蚜虫的抗性。此外，Bt抗虫棉叶片Bt毒素含量与天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和精氨酸及其浓度密切相关[25]。本研究中，蓟马为害后，‘草原2号’和‘草原4号’的脯氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸含量都有不同程度的上升，因此脯氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸的浓度也可能与苜蓿的抗蓟马性有关。

硫元素对于植物的抗病虫能力起着重要作用[26]。在蓟马为害后，‘草原2号’蛋氨酸含量显著上升(P<0.05)，‘草原4号’半胱氨酸含量显著上升(P<0.05)，蛋氨酸含量也上升了36.11%。未受到蓟马为害时，与‘草原2号’相比，‘草原4号’的L-半胱氨酸、L-高半胱氨酸等含硫氨基酸衍生物上调。‘草原2号’受到蓟马为害后，L-半胱氨酸、L-高半胱氨酸等含硫氨基酸衍生物也上调。因此，我们推测含硫氨基酸在苜蓿抗蓟马过程中具有重要作用。

‘草原2号’受到蓟马为害后产生了23种差异氨基酸衍生物，‘草原4号’受到蓟马为害后只产生了7种差异氨基酸衍生物，抗蓟马品种的氨基酸衍生物变化远小于感蓟马品种，说明抗蓟马品种具有更强的自我缓冲能力。受到蓟马为害后2种苜蓿合成了大量的具有抗氧化能力的氨基酸衍生物，如左旋肌肽等[27]，同时合成了N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺和苯乙酰甘氨酸。因此，这些氨基酸可能同苜蓿的诱导性防御密切相关。当植物处于逆境条件下，活性氧的产生与清除的动态平衡被破坏，活性氧大量累积会损伤细胞[28]。抗蓟马苜蓿品种可以及时清除体内的活性氧使其保持在较低水平[29]。谷胱甘肽及其衍生物是植物清除活性氧的一种信号传导物质[30]，这种调节机制可能来源于抗虫品种合成了更多抗氧化功能的氨基酸衍生物，如谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸等。本研究发现，谷胱甘肽还原型、氧化谷胱甘肽、S-甲基谷胱甘肽等与谷胱甘肽代谢通路相关的氨基酸及其衍生物在收到蓟马为害后显著下调，说明谷胱甘肽代谢通路可能同苜蓿抗蓟马密切相关。

本试验探究了牛角花齿蓟马为害后，抗蓟马苜蓿和感蓟马苜蓿叶片中氨基酸及氨基酸衍生物种类和含量的变化，以及各种氨基酸含量变化与苜蓿抗蓟马的关系。但是对于氨基酸及氨基酸衍生物发挥的具体作用分析较少，后续将结合本试验的结果，继续深入探究。

4 结论

综上所述，抗蓟马苜蓿和感蓟马苜蓿氨基酸总含量无显著性差异。蓟马取食可以导致苜蓿叶片氨基酸总含量显著下降，其中主要包括天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸和缬氨酸。相较于感蓟马材料，抗蓟马品种的天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸和酪氨酸含量较高，苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和精氨酸含量较低。含硫或含苯环氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸、苯乙酰甘氨酸和N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺可能与苜蓿诱导性蓟马防御反应有关；谷胱甘肽还原型、氧化谷胱甘肽、S-甲基谷胱甘肽等谷胱甘肽代谢通路相关的氨基酸的变化说明谷胱甘肽可能同苜蓿的抗蓟马性密切相关。