Bax 抑制因子1 过表达对急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制

万朝辉, 曾 良, 周 辉

（1.南华大学附属第二医院急诊科，湖南 衡阳 421001；2.南华大学附属第三医院急诊科，湖南 衡阳 421900）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI） 是一种全球性的危重病，近些年，中国AMI 的发病率和死亡率持续上升。AMI 发生的主要原因是冠状动脉粥样硬化引起血管阻塞和斑块破裂，且发生过度炎症，导致心肌细胞坏死和凋亡。研究［1-2］显示：细胞凋亡主要发生在心肌组织缺血区，容易触发AMI 后心脏重构和心力衰竭。因此，预防和减少心肌细胞凋亡可改善AMI 后心功能不全和心脏重构，是AMI 治疗的关键点。B 细胞淋巴瘤2 （B-cell lymphoma-2，Bcl-2） 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax） 抑制剂1 （Bax inhibitor-1，BI-1） 基因定位于人类12 号染色体上，是一个单拷贝和高度保守的基因。研究［3］表明：BI-1 具有抗凋亡功能。BI-1 过表达可抑制神经细胞凋亡，改善蛛网膜下腔出血模型大鼠神经评分，降低脑组织含水量［4］。研究［5］显示：BI-1 与内质网和核膜的细胞内膜生理功能有关，且BI-1 对内质网应激诱导的细胞凋亡具有保护作用。但BI-1 是否对AMI 心肌组织有保护作用目前尚无相关报道。本研究通过探讨过表达BI-1 对AMI 大鼠心肌细胞凋亡的影响，阐明其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 清洁级8 周龄SD 雄性大鼠60 只，体质量180～220 g，购于湖南省斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK （湘） 2014-0012。大鼠在18 ℃～26 ℃和相对湿度40%～70% 的SPF 环境中适应性饲养1 周，通风换气每小时8～12 次，自由饮食和摄水。BI-1 过表达质粒（GV345） 和空载质粒的构建及其腺病毒包装等均由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水酶3（cysteinyl aspartate specific proteinases-3，Caspase-3）活性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，TUNEL 凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，兔抗BI-1、 肌醇依赖酶1 （inositolrequiring kinase-1，IRE1）、磷酸化IRE1 （phospho rylated IRE1，p-IRE1）、Bcl-2、Bax 和β-actin 单克隆抗体购自英国ABCAM 公司，鼠抗葡萄糖调节蛋白78 （glucose-regulated protein 78 ，GRP78）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） 和磷酸化JNK （phosphorylated JNK ，p-JNK） 单克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司。Vevo 2100 超声系统购自加拿大VisualSonics 公司，多功能酶标仪购自美国Thermo 公司，2500 凝胶成像仪购自上海天能科技有限公司，7500 荧光定量PCR 仪购自美国ABI公司。

1.2 实验动物模型制备、实验动物分组和处理采用冠状动脉左前降支结扎法建立AMI 动物模型［6］。腹腔注射35 mg·kg－1戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，行颈部切口，连接呼吸机，以正压通气，呼吸比1∶2，潮气量8 mL，呼吸频率120 min－1。待大鼠呼吸平稳后，行胸部切口，暴露心脏后结扎冠状动脉左前降支。当心电图记录仪上ST 段向上抬高呈弓背型，心率缓慢，结扎部位下方或左心室变白，说明AMI 模型制作成功。60 只大鼠随机分为假手术组、 模型组、 空载腺病毒（Ad-NC） 组和BI-1腺病毒（Ad-BI-1） 组，每组15 只。模型组大鼠采用冠状动脉左前降支结扎法建立AMI 动物模型； Ad-NC 组和Ad-BI-1 组大鼠在建模后于心肌梗死区域选择3 个位点，分别注射10 μL 腺病毒包装的空载质粒或BI-1 过表达质粒溶液（2×1010PFU·mL－1）；假手术组大鼠行切口后，只穿线不结扎冠状动脉左前降支，同时与模型组大鼠在心肌梗死区域的相同位置注射等量生理盐水。术后72 h待检测心功能后，处死大鼠，取心脏置于－ 80 ℃冰箱中冻存待检测。

1.3 大鼠心功能指标检测术后72 h，所有大鼠均腹腔注射35 mg·kg－1戊巴比妥钠溶液进行麻醉，用Vevo 2100 超声系统检测大鼠在3 个连续心动周期中的左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、 左室缩短分数（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD） 和左室收缩末期内径（left ventricular end systolic diameter，LVESD） 值。

1.4 TTC 染色法检测大鼠心肌梗死面积百分率取冻存的大鼠心脏，沿左心室横轴方向从心尖到结扎点，每隔2 mm 切片，每片1 mm，立刻置于1% TTC 溶液中避光孵育15 min，完成染色后洗去多余染料，拍照后，采用Image J 软件统计分析梗死区面积与切片面积比值，即心肌梗死面积百分率。正常心肌组织呈红色，梗死区心肌组织呈灰白色。

1.5 比色法检测大鼠心肌组织中Caspase-3 活性取冷冻的结扎线以下部分大鼠左心室心肌组织，制备成组织匀浆后，根据Caspase-3 活性检测试剂盒说明书操作，采用多功能酶标仪检测大鼠心肌组织中Caspase-3 活性。

1.6 TUNEL 法检测大鼠心肌细胞凋亡率取冷冻的结扎线以下大鼠左心室部分心肌组织，4% 多聚甲醛固定，30% 蔗糖溶液脱水，制作成冰冻切片，滴加0.5% Triton X-100 溶液室温孵育5 min，根据TUNEL 试剂盒操作步骤加50 μL TUNEL 检测液、5 μL TdT 酶和45 μL 荧光标记液，37 ℃避光孵育1 h，用PBS 缓冲液洗涤3 次后，滴加DAPI避光染核10 min，加入抗荧光淬灭封片液封片，在荧光显微镜下观察，绿色荧光为凋亡细胞。随机观察5 个阳性视野，计数100 个细胞，计算凋亡细胞所占百分率，即细胞凋亡率。

1.7 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法检测大鼠心肌组织中BI-1 mRNA 表达水平取适量冻存的结扎线以下大鼠左心室心肌组织，采用Trizol 法提取心肌组织中总RNA。利用一步法将总RNA 逆转录为cDNA 后，进行RT-qPCR 扩增。BI-1：上游引 物5′-AGTTCTCCCAGATATCTCGCTC-3′，下 游引物5′-ATGGCCAGGATGACCATC-3′；β-actin ：上游引物5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游引物5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′。反应程序：95 ℃、15 s，60 ℃、35 s，共40 个循环。以β-actin 为内参，采用2－ΔΔCt法计算大鼠心肌组织中BI-1 mRNA 表达水平。

1.8 Western blotting 法检测大鼠心肌组织中相关蛋白表达水平取适量冻存的结扎线以下大鼠左心室心肌组织，加入预冷的RIPA 裂解液制备成组织匀浆，提取总蛋白。95 ℃蛋白变性后，取30 μg 蛋白在12 %的SDS-PAGE 胶上电泳分离，湿转到硝酸纤维素膜上，用5% 脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗兔抗BI-1 （1∶1 000）、p-IRE1 （1∶1 000）、IRE1 （1 ∶1 000）、 Bax （1 ∶500）、 Bcl-2（1 ∶500） 和β -actin （1∶5 000），鼠抗GRP78（1∶1 000）、p-JNK （1∶500） 和JNK （1∶1 000），4 ℃孵育过夜。用TBST 洗涤3 次后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗室温孵育1 h，TBST 洗涤3 次后，加入增强型化学发光剂，曝光显影，置入凝胶电泳仪中拍照并分析蛋白灰度值。采用Image-Pro 6.0 软件计算各泳道蛋白灰度值，目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值，同时计算p-IRE1/IRE1 和p-JNK/JNK 比值。

1.9 统计学分析采用SPSS 21.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠心功能指标LVEF、LVFS、LVEDD 和LVESD，心肌梗死面积，心肌组织中Caspase-3 活性和心肌细胞凋亡率，心肌组织中BI-1 mRNA 和蛋白表达水平，心肌组织中Bcl-2、Bax、 GRP78 蛋白表达水平和p-IRE1/IRE1 及p-JNK/JNK 比值均符合正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心功能指标与假手术组比较，模型组大鼠LVEF 和LVFS 明显降低（P＜0.05），LVEDD 和LVESD 明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，Ad-BI-1 组大鼠LVEF 和LVFS 明显升高（P＜0.05），LVEDD 和LVESD 明显降低（P＜0.05），而Ad-NC 组大鼠上述各指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠心功能指标Tab.1 Indicators of heart function of rats in various groups （n=15，±s）

表1 各组大鼠心功能指标Tab.1 Indicators of heart function of rats in various groups （n=15，±s）

*P＜0.05 vs sham operation group；△P＜0.05 vs model group.

G r o u p S h a m o p e r a t i o n M o d e l A d-N C A d-B I-1 L V E F（η/%）8 2.1 3±2.2 6 4 6.5 2±7.5 5*4 8.0 3±4.6 7 6 6.1 5±5.0 2△L V F S（η/%）5 1.0 9±5.8 5 2 3.7 5±4.4 7*2 5.2 1±6.1 2 3 7.8 9±3.2 5△L V E D D（d/m m）5.0 8±0.3 9 7.5 2±0.6 1*7.3 8±0.8 2 5.9 5±0.4 5△L V E S D（d/m m）2.7 9±0.2 4 5.8 2±0.5 7*5.6 4±0.4 8 3.6 3±0.3 8△

2.2 各组大鼠心肌梗死面积百分率和心肌组织中Caspase-3 活性与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死面积百分率和心肌组织中Caspase-3 活性明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，Ad-BI-1 组大鼠心肌梗死面积百分率和心肌组织中Caspase-3 活性明显降低（P＜0.05），而Ad-NC 组大鼠上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠心肌梗死面积百分率和心肌组织中Caspase-3活性Tab.2 Percentages of myocardial infarction areas and Caspase-3 activities in myocardium tissue of rats in various groups (n=15，±s）

表2 各组大鼠心肌梗死面积百分率和心肌组织中Caspase-3活性Tab.2 Percentages of myocardial infarction areas and Caspase-3 activities in myocardium tissue of rats in various groups (n=15，±s）

*P＜0.05 vs sham operation group；△P＜0.05 vs model group.

Group Sham operation Model Ad-NC Ad-BI-1 Percentage of myocardial infarction area (η/%)0.00±0.00 32.05±3.64*31.67±4.15 16.88±5.82△Caspase-3 activity[λB/(U·mg－1)]0.69±0.12 8.58±0.55*8.14±0.83 4.43±0.67△

2.3 各组大鼠心肌细胞凋亡率和凋亡相关蛋白表达水平与假手术组（1.53%±0.88%） 比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡率（33.73%±4.68%） 明显升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），Bax 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，Ad-BI-1 组大鼠心肌细胞凋亡率（15.40%±4.39%） 明显降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），Bax 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），而Ad-NC 组大鼠上述各指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1 和2。

图1 各组大鼠心肌组织TUNEL 染色结果（×200）Fig.1 TUNEL staining results of myocardium tissue of rats in various groups（×200）

2.4 各组大鼠心肌组织中BI-1 mRNA 和蛋白表达水平与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中BI-1 mRNA 和蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与Model 组比较，Ad-BI-1 组大鼠心肌组织中BI-1 mRNA 和蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），而Ad-NC 组大鼠心肌组织中BI-1 mRNA 和蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3 和4。

图3 各组大鼠心肌组织中BI-1 mRNA 表达水平Fig.3 Expression levels of BI-1 mRNA in myocardium tissue of rats in various groups

2.5 各组大鼠心肌组织中GRP78 蛋白表达水平和p-IRE1/IRE1 及p-JNK/JNK 比值与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中GRP78 蛋白表达水平和p-IRE1/IRE1 及p-JNK/JNK 比值明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，Ad-BI-1 组大鼠心肌组织中GRP78 蛋白表达水平和p-IRE1/IRE1 及p-JNK/JNK 比值明显降低（P＜0.05），而Ad-NC 组大鼠上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

图5 各组大鼠心肌组织中GRP78、p-IRE1、IRE1、p-JNK 和JNK 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig.5 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of GRP78，p-IRE1，IRE1，p-JNK，and JNK proteins in myocardium tissue of rats in various groups

3 讨 论

AMI 是世界范围内主要的心血管疾病致死原因。在中国，每年有70 多万患者死于AMI［7］。AMI 能引起心脏供血不足，导致心肌坏死。研究［8-10］显示：检测大鼠在连续心动周期中LVEF、LVFS、LVEDD 和LVESD，若LVEF 和LVFS 降低，且LVEDD 和LVESD 升高，说明大鼠心功能出现异常。另外，AMI 的严重程度与心肌梗死面积呈正相关关系。本研究结果表明：AMI 造模后，大鼠心功能出现异常，心肌梗死面积百分率明显升高，说明成功建立AMI 大鼠模型。Caspases 家族在介导细胞凋亡过程中具有重要作用，其中Caspase-3 是凋亡的关键执行分子。在凋亡早期，Caspase-3 被激活，裂解胞浆底物，最终导致细胞凋亡［11-12］。本研究结果显示：AMI 大鼠心肌细胞凋亡率升高，凋亡蛋白Caspase-3 活性明显升高，且抗凋亡蛋白Bcl-2 表达下调而促凋亡蛋白Bax 表达上调，说明AMI 大鼠发生心肌细胞严重凋亡情况。

BI-1 在正常细胞和组织中均有表达，包括心脏、大脑、胎盘、肝脏、骨骼肌、肾脏和胰腺组织［13-14］，且在细胞凋亡率高的部位优先表达，表明局部细胞凋亡活动受到机体凋亡途径的严格调控［15-16］。研究［17-19］显示：BI-1 基因敲除可促进蛛网膜下腔出血大鼠海马组织的损伤并提高神经元的凋亡率；过表达BI-1 能使缺氧缺血性脑损伤大鼠脑组织相对梗死面积缩小，神经元变性减弱，有效改善缺氧缺血性脑损伤大鼠的神经功能，且沉默BI-1表达能逆转其保护作用；在非酒精性脂肪性肝病患者中，肝组织活检显示BI-1 下调；在非酒精性脂肪肝小鼠中，BI-1 基因敲除后出现异常的肝组织炎症和损伤。本研究结果表明：过表达BI-1 能明显改善AMI 大鼠心功能，有效降低心肌梗死面积百分率，并抑制心肌组织Caspase-3 活性，降低心肌细胞凋亡率，表明BI-1 通过抗凋亡作用在AMI 发展过程中起保护作用。

图2 各组大鼠心肌组织中Bcl-2 和Bax 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig.2 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of Bcl-2 and Bax proteins in myocardium tissue of rats in various groups

图4 各组大鼠心肌组织中BI-1 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig.4 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expression of BI-1 protein in myocardium tissue of rats in various groups

内质网应激通过未折叠蛋白的积累触发未折叠蛋白反应，导致促凋亡级联的激活，诱导细胞死亡。在过度和长期的内质网应激条件下，由于大量错误折叠的蛋白质的积累，不饱和蛋白反应转向凋亡途径，其中GRP78、JNK 和IRE-1 蛋白是内质网应激诱导细胞凋亡调控途径中的关键因子［15，20］。研究［17］显示： BI-1 是一种进化上保守的蛋白，由含6 个基因的跨膜Bax 抑制剂基序编码，是一种新的内质网应激诱导新生大鼠脑损伤后细胞凋亡的调节剂，并且BI-1 的保护作用是通过抑制IRE1α 信号传导介导的。BI-1 可通过调节IRE1-JNK 通路影响蛛网膜下腔出血后早期脑损伤程度［16］。上述研究结果表明：BI-1 通过调控内质网途径，影响一些疾病的发展，但BI-1 对AMI 心肌细胞的凋亡的影响及其可能的机制尚未见报道。本研究结果显示：过表达BI 能明显抑制内质网途径相关因子的表达，进而抑制细胞凋亡，说明BI-1 可能通过抑制内质网途径活性，减轻AMI 大鼠心肌细胞凋亡。

综上所述，过表达BI-1 能有效缓解AMI 后大鼠心功能，减轻心肌细胞损伤，其机制可能与过表达BI-1 抑制内质网途径活性有关。