鼻咽癌斑马鱼移植瘤模型的构建及姜黄素对CNE-2 细胞的抑制作用

王泽泰, 娄丹丹, 彭 燕, 朱道琦, 李爱武, 宫凤英, 吕 英, 范 钦

（1.南方医科大学中医药学院分子生物学教研室，广东 广州 510515；2.南方医科大学南方医院古中医科，广东 广州 510515）

鼻咽癌是一种于我国南方地区高发的头颈部恶性肿瘤，目前的治疗手段有放疗、化疗、手术和靶向治疗等［1］，但放化疗抵抗的产生和严重的不良反应常导致鼻咽癌患者治疗失败［2］。因此，寻找治疗鼻咽癌新型有效药物成为亟待解决的问题。中药具有多靶点效应、不良反应少和不易产生耐药性等优势，因而成为抗肿瘤药物研究的热点。

姜黄素是从姜黄根茎中提取的天然中药单体，为姜黄的主要活性成分［3］，中医认为其具有破血消瘀作用。现代研究［4］表明：姜黄素具有抗炎、免疫调节、增强放化疗和抗肿瘤等多种药理作用。目前姜黄素抗鼻咽癌的研究仍以细胞培养和小鼠模型为主，因此建立更多的鼻咽癌动物模型对研究鼻咽癌的发生发展规律和防治措施具有重要作用。

斑马鱼是一种原产于印度和巴基斯坦等国家的小型热带淡水鱼，目前已经成为生命科学领域公认的脊椎动物模型［5］。与经典的小鼠/大鼠模型比较，主要有以下优势［6-7］：①体外受精、体外发育，易于获得胚胎进行生物医学研究和药物实验；②胚胎透明，可直接观察体内器官，结合活体染料、抗体和核酸探针等方法，有利于了解体内肿瘤的生物学特性；③易于繁殖，产卵量大，发育较快，研究耗时短，实验通量高；④与哺乳动物的生理、发育和代谢途径相似，且与人类基因组同源性高，是预测疾病的良好模型。基于以上优点，斑马鱼已被广泛应用于发育生物学、分子生物学、肿瘤学、遗传学、神经生物学和免疫学等多种研究领域。近几年来，斑马鱼移植瘤动物模型在肿瘤研究领域迅速兴起，不仅可以用于研究肿瘤血管生成、细胞迁移和药物反应，还可以作为个性化癌症治疗的实时体内平台［8-9］，凭借高通量和低成本的特色在医学研究中发挥着不可替代的作用。

本研究以斑马鱼为动物载体，建立鼻咽癌斑马鱼移植瘤模型，明确姜黄素对鼻咽癌的抑制作用，并研究了姜黄素对CNE-2 细胞增殖和迁移的影响，旨在探讨鼻咽癌斑马鱼移植瘤模型能否准确评价姜黄素的治疗效果，为该模型应用于肿瘤药物的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞

人低分化鼻咽癌CNE-2 细胞株（中山大学肿瘤防治中心惠赠），37 ℃、5% 二氧化碳（CO2） 的孵育条件下，在含有10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养。每天换液，细胞生长至培养瓶70%～80% 时用0.25% 胰蛋白酶消化传代培养。AB 野生型斑马鱼，由国家斑马鱼资源中心提供。标准环境下饲养于28.5 ℃恒温斑马鱼培养系统中，光照条件为14 h：10 h 明暗交替，每日2 次喂食孵化后的千年虫。

1.2 主要试剂和实验器材

RPMI 1640 培养基、 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS） 和胰酶（美国Gibco 公司），CCK-8试剂（中国Abbkine 公司），姜黄素（中国曼斯特公司），细胞膜红色荧光染色剂CM-Dil （上海碧云天生物技术有限公司）。斑马鱼培养系统（中国海圣公司），斑马鱼注射仪（日本Nikon 公司）。

1.3 CM-DiI 染色检测CNE-2 细胞荧光强度CNE-2 细胞分为对照组和CM-Dil 组，2 组细胞初始密度一致。CM-DiI 组细胞用胰酶消化后重悬吹打为单细胞悬液，1 mL 细胞悬液加入5 μL 活细胞染色剂CM-DiI。置于5% CO2培养箱中孵育10～15 min。PBS 缓冲液清洗3 次后用RPMI 1640培养基重悬，连续5 d 进行细胞计数，观察荧光强度。每组重复3 次，并绘制细胞生长曲线。

1.4 人鼻咽癌斑马鱼模型的构建

1.4.1 斑马鱼胚胎收集 挑选性成熟的AB 型斑马鱼4～5 对进行繁殖，于次日将胚胎收集至培养皿中，每皿约100～200 个受精卵，用吸管吸干净杂质及未受精的乳白浑浊卵，置于28 ℃孵箱进行孵育，每日更换培养液。

1.4.2 琼脂板的制备 称取1g 琼脂糖粉在烧瓶中，加入100 mL 去离子水，微波炉加热沸腾后倒进干净培养皿，待冷却后制作成摆放斑马鱼的平板，以供显微注射时用。

1.4.3 细胞染色 CNE-2 细胞用胰酶消化后重悬吹打为单细胞悬液，取5 μL CM-Dil，加入到1 mL细胞悬液中。在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育10～15 min，PBS 缓冲液洗3 次后用RPMI 1640 培养基重悬，显微镜下计数并调整浓度为2×107mL－1，置于冰上备用。

1.4.4 斑马鱼胚胎的麻醉及注射 斑马鱼胚胎分为对照组、PBS 组和模型组。每皿取30 个受精后天数（days postfertilization，dpf） 为2 的斑马鱼胚胎，用0.001% 三卡因溶液麻醉后，用吸管轻轻吸至湿润的浓度为1.0% 的琼脂板上，整齐均匀摆放以方便注射。将盛放斑马鱼胚胎的琼脂板置于显微镜视野中央，将注射针插入到模型组斑马鱼胚胎的卵黄囊中，注入已染色的鼻咽癌CNE-2 细胞，每个胚胎注射细胞悬液10 nL，约200 个细胞；对照组斑马鱼胚胎不进行处理，PBS 组斑马鱼胚胎注射等量PBS 缓冲液。注射后立即于荧光显微镜下成像，评估是否注射成功。之后将注射成功的斑马鱼置于孵箱中培养，用于后续实验。

1.5 HE 染色观察斑马鱼移植瘤组织形态表现

取对照组（未注射CNE-2 细胞） 和模型组斑马鱼于10% 甲醛固定液中固定，4 ℃过夜，以保持细胞形态结构。洗涤脱水，浸蜡包埋后制备病理切片。苏木素和伊红（HE） 染色后封片，于显微镜下观察模型组斑马鱼移植瘤组织形态表现，进行图像采集分析。

1.6 姜黄素体内用药浓度筛选

将3 dpf 的斑马鱼胚胎分为对照组（ 0 μ mol·L－1姜黄素组） 和不同浓度（0.625、1.250、2.500、5.000、7.500 和10.000 μmol·L－1）姜黄素组，每组30 条，姜黄素作用48 h 后统计各组斑马鱼死亡数和致畸数，并计算斑马鱼死亡率。

1.7 姜黄素干预后各组斑马鱼移植瘤荧光强度和发生移植瘤头尾部转移的斑马鱼数

用饲养水将姜黄素终浓度调整至筛选出的工作浓度0、0.625、1.250、2.500 和5.000 μmol·L－1，0 μmol·L－1姜黄素组为对照组。将3 dpf 的斑马鱼模型置于上述配制好的姜黄素饲养水中，置于孵箱中48 h。分别选取3 和5 dpf （姜黄素作用48 h） 的斑马鱼模型于宏观体式显微镜荧光状态下拍照。利用Image J 软件分析处理荧光图片，对各组的荧光强度进行定量分析。统计各组发生移植瘤头尾部转移的斑马鱼数。

1.8 CCK-8 法检测各组细胞增殖率

取处于对数生长期的CNE-2 细胞，用含10%FBS 的完全培养液调整细胞浓度为2×104mL－1，96 孔细胞培养板每孔接种100 μL ，设空白组（不加细胞）、 对照组和10 及20 μmol·L－1姜黄素组，每组5 个复孔。37 ℃培养24 h 后终止培养，每孔加入10 μL CCK-8 溶液。37 ℃孵育2 h 后，酶标仪检测波长450 nm 处的吸光度（A） 值，计算细胞增殖率。细胞增殖率=（加药组A 值－空白组A 值） /（对照组A 值－空白组A 值） ×100%。

1.9 划痕试验检测各组细胞迁移率

细胞分组同“1.8”，取处于对数生长期的CNE-2 细胞，均匀接种于6 孔细胞培养板中，每孔加入5×105个细胞。常规条件下培养，待细胞生长铺满板底时，用200 μL 移液器吸头于6 孔板孔中心轴处划1 条均匀直线。用PBS 缓冲液洗去划落的细胞，对照组细胞中加入RPMI 1640 培养基，不同剂量姜黄素组细胞中分别加入含10 和20 μmol·L－1姜黄素的培养基。按0 和24 h 取样，于倒置荧光显微镜下拍照，采用Image J 软件处理分析记录划痕面积，计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h 划痕面积－24 h 划痕面积） /0 h 划痕面积×100%。

1.10 统计学分析

采用SPSS 21.0 统计软件进行统计学分析。2 组细胞数和荧光强度，各组斑马鱼存活数、畸形数和移植瘤荧光强度，各组细胞增殖率和迁移率均符合正态分布，以x±s表示，2组间样本均数（2组细胞数和荧光强度） 比较采用独立样本t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，方差不齐采用Tamhane’s T2 （M） 法分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CM-DiI 标记后2 组细胞数和荧光强度

体外实验中，通过细胞膜红色荧光染色剂CM-DiI 标记，连续5 d 细胞计数，与对照组比较，CM-Dil 组细胞数差异无统计学意义（t=1.642，P＞0.05）（图1）。显微镜下观察：红色荧光强度随着细胞数的增加而增强（图2），表明CM-Dil 染料对细胞增殖无明显影响，可用于体外活细胞标记并反映细胞的生长情况。

图1 CM-DiI 标记后各组CNE-2 细胞数Fig.1 Number of CNE-2 cells in various groups after CM-DiI labeling

图2 CM-DiI 标记后不同时间CNE-2 细胞荧光强度（×40）Fig.2 Fluorescence intensities of CNE-2 cells after CM-DiI labeling (×40)

2.2 各组斑马鱼存活数和体内移植瘤荧光强度

在5 dpf 时，与对照组（71±1） 比较，PBS 组斑马鱼存活数（72±2） 差异无统计学意义（P＞0.05）；与对照组和PBS 组比较，模型组斑马鱼存活数（58±3） 明显减少（P＜0.01）。注射后第1、3 和5 天（即3、5 和7 dpf） 模型组斑马鱼体内红色荧光细胞数随时间的延长而增加，荧光强度分别为（21.084±1.102）、（24.351±0.365） 和（28.572±1.36） 像素×106；与3 dpf 比较，7 dpf 模型组斑马鱼体内移植瘤荧光强度明显增强（P＜0.05）。提示CM-Dil 染料可用于体内活细胞标记反映细胞的生长情况。见图3。

图3 显微注射后各组斑马鱼存活数和斑马鱼体内移植瘤荧光强度Fig.3 Survival number and fluorescence intensity of transplanted tumor of zebrafish in various groups after microinjection

2.3 模型组斑马鱼移植瘤组织形态表现

与对照组比较，模型组斑马鱼肿瘤组织生长良好，无明显坏死，细胞核形态大且明显，边缘清晰，细胞膜完整，偶有空泡。见图4。

图4 斑马鱼移植瘤组织形态表现Fig.4 Morphology of transplanted tumor tissue of zebrafishes

2.4 姜黄素体内给药浓度

斑马鱼暴露于含姜黄素的饲养水2 d，在浓度小于或等于5.000 μmol·L－1姜黄素处理组中，斑马鱼未发生死亡及毒性反应，而姜黄素浓度增加至7.500 和10.000 μmol·L－1时，可诱发斑马鱼死亡以及畸形，死亡率分别为（16.7±3.3）% 和（46.7±3.3）%。见图5 和表1。根据上述实验结果，将5.000 μmol·L－1作为最大安全浓度。选取0.625、1.250、2.500 和5.000 μmol·L－1姜黄素进行后续试验，用于评价姜黄素对鼻咽癌移植瘤生长和转移的作用。

表1 不同浓度姜黄素作用48 h 后斑马鱼死亡率和畸形数Tab.1 Rates of death and number of deformity of zebrafishes after treated with different concentrations of curcumin for 48 h(n=30，±s）

表1 不同浓度姜黄素作用48 h 后斑马鱼死亡率和畸形数Tab.1 Rates of death and number of deformity of zebrafishes after treated with different concentrations of curcumin for 48 h(n=30，±s）

Group Control Curcumin（μmol·L－1）0.625 1.250 2.500 5.000 7.500 10.000 Number of death 0 0 0 0 0 5±1 14±1 Rate of death (η/%)0 0 0 0 0 16.7±3.3 46.7±3.3 Number of deformity 0 0 0 0 0 6±1 11±2

图5 不同浓度姜黄素作用后斑马鱼的畸形情况Fig.5 Malformation of zebrafishes after treated with different concentrations of curcumin

2.5 姜黄素干预后各组斑马鱼移植瘤荧光强度

姜黄素干预48 h 后，显微镜下观察各组斑马鱼移植瘤荧光强度。与对照组（0 μmol·L－1组） 比较，0.625 和1.250 μmol·L－1姜黄素组斑马鱼移植瘤荧光强度有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），2.500 和5.000 μmol·L－1姜黄素组斑马鱼移植瘤荧光强度明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），且呈剂量依赖性。见图6 和表2。

表2 姜黄素作用48 h 后各组斑马鱼移植瘤荧光强度Tab.2 Fluorescence intensities of transplanted tumor of zebrafishes in various groups after treated with curcumin for 48 h (n=30，±s，pixel×106）

表2 姜黄素作用48 h 后各组斑马鱼移植瘤荧光强度Tab.2 Fluorescence intensities of transplanted tumor of zebrafishes in various groups after treated with curcumin for 48 h (n=30，±s，pixel×106）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control Curcumin（μmol·L－1）0.625 1.250 2.500 5.000 Fluorescence intensity 24.351±0.298 24.187±0.660 24.356±0.752 22.510±0.211*18.844±0.154**

图6 体式显微镜下观察各组斑马鱼移植瘤的荧光强度Fig.6 Fluorescence intensities of transplanted tumor of zebrafishes in various groups

2.6 各组发生头尾部转移的斑马鱼数

与对照组比较，0.625、1.250和2.500 μmol·L－1姜黄素组发生头尾部转移的斑马鱼数有所减少，但差异无统计学意义（P＞0.05），5.000 μmol·L－1姜黄素组发生头尾部转移的斑马鱼数明显减少（P＜0.05）。见图7。

图7 各组斑马鱼移植瘤表现（A,B）和发生头尾部转移的斑马鱼数（C）Fig.7 Performance of transplanted tumor of zebrafishes (A,B) and number of zebrafishes with head and tail metastasis (C)after treated with different concentrations of curcumin

2.7 姜黄素作用后各组CNE-2 细胞增殖率

给药24 h 后，对照组和10 及20 μmol·L－1姜黄素组CNE-2 细胞增殖率分别为100%、（80.8±1.0） % 和（63.8±2.7） % 。与对照组 比较，10 和20 μmol·L－1黄素组CNE-2 细胞增殖率明显降低（P＜0.01），且呈剂量依赖性。

2.8 各组CNE-2 细胞迁移率

与对照组（93.7%±2.0%） 比较，10 和20 μmol·L－1姜黄素组细胞迁移率（87.9%±2.0%和 79.0%±3.0%） 明显降低（P＜0.01） 。见图8。

图8 细胞划痕实验检测各组CNE-2 细胞迁移情况(×40)Fig.8 Cell migration of CNE-2 cells in various groups detected by wound healing assay(×40)

3 讨 论

目前，斑马鱼疾病模型涉及广泛，包括血液疾病［10］、心血管疾病［11］、癌症［12］、骨骼疾病［13］、代谢疾病［14］和传染病［15］等。基于斑马鱼研究平台，结合中医药优势和特色，中药的活性筛选和毒性评价相关研究正逐渐深入［16］。LI 等［17］研究发现：补骨脂酚能够降低斑马鱼异种移植中乳腺癌MCF-7细胞数量而死亡率并未升高。YANG 等［18］利用斑马鱼模型对西藏大戟化合物进行研究发现：大戟化合物对人肺癌A549 细胞的生长表现出抑制作用和抗血管生成作用。GUO 等［19］建立乳腺癌异种移植瘤斑马鱼模型，检测防己黄芪汤对异种肿瘤斑马鱼上皮- 间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 生物标志物表达的调控，结果显示：防己黄芪汤可以明显降低Snail 家族转录抑制因子2 （Snail family transcriptional repressor 2，Snail2）、锌指E-box 结合同源框2 （zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2）、 Twist 家 族BHLH 转录因子1 （Twist family bhlh transcription factor 1，TWIST1） 和转化生长因子β （transforming growth factor-β，TGF-β） 等的表达，并增加上皮钙黏蛋白（epithelial cadherin，E-cadherin） 的表达，从而揭示了防己黄芪汤在体内抑制癌细胞增殖和侵袭的相关作用机制。ZHOU 等［20］证明：凉膈散在斑马鱼炎症模型和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 刺激的RAW 264.7 细胞中具有抗炎活性，且与磷酸化c-Jun 氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK） 和磷酸化神经生长因子诱导的基因B （phosphorylated nerve growth factor-induced gene B，NGFI-B） 的抑制有关。

然而，斑马鱼模型也有一定的局限性［12，21］：与哺乳动物比较，斑马鱼特殊的给药方式和药物吸收方式会影响药效学和药动学评价；斑马鱼胚胎和幼鱼体积较小，不易操作，且较难收集足够的组织；异种胚胎保持在35 ℃时有利于斑马鱼的发育，但可能会对研究结果产生影响；斑马鱼研究方法和检测指标尚不完善，目前可用的实验仪器和抗体较少。因此，必须进一步推进斑马鱼动物模型标准化，并结合CRISPR 基因编辑技术、新兴成像技术和新的行为方法等前沿技术［22］，开展全面深入的分子机制研究，从而推动医学对疾病的认识和治疗。

本研究构建了斑马鱼鼻咽癌移植瘤模型，确定2.5 和5.0 μmol·L－1姜黄素作为干预模型的药物浓度，证实了姜黄素对斑马鱼鼻咽癌移植瘤细胞增殖和迁移具有抑制作用，并在体外CNE-2 细胞中得到了一致的结论。本研究结果表明：姜黄素具有成为抗鼻咽癌药物的潜能，同时斑马鱼移植瘤模型也可以成为鼻咽癌肿瘤研究和药物评价的重要模型。未来本课题组将在基因和蛋白水平探讨姜黄素体内抗肿瘤的分子机制，为中药抗肿瘤的临床应用提供理论依据。