N-乙酰半胱氨酸对尼古丁诱导的MC3T3-E1 细胞凋亡的作用及其机制

崔磊华, 侯玉帛, 苏 畅, 李明贺, 聂 鑫

（1.温州医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，浙江 温州 325000；2.温州医科大学附属口腔医院牙周科，浙江 温州 325000；3.吉林大学口腔医院口腔颌面外科，吉林 长春 130021）

牙周炎是以牙周结缔组织破坏和牙槽骨吸收为特点的慢性炎症性疾病，是成人失牙的主要原因之一［1］。研究［2］显示： 吸烟是牙周炎的高危因素，戒烟可降低其发病率，缓解牙周组织损伤。尼古丁是烟草中主要的成瘾性成分，随着尼古丁替代疗法在戒烟治疗中的广泛应用，尼古丁对人类健康的影响受到越来越多的关注［3］。研究［4］显示：尼古丁可破坏机体骨代谢平衡，已成为骨折愈合、骨质疏松、类风湿性关节炎等骨代谢相关疾病的危险因素。研究［5-6］证实：尼古丁可协同牙周局部炎症反应加剧牙周骨组织破坏。然而部分吸烟患者牙周组织表现为轻微炎症反应却伴随重度牙槽骨吸收，因此探讨尼古丁对骨稳态系统的调控机制，对维护吸烟者牙周健康具有重要意义。

研究［7-8］显示：慢性牙周炎患者牙周骨组织破坏程度与局部氧化应激反应呈正相关关系，而烟草燃烧过程中生成的过量活性氧簇可直接攻击牙周组织细胞，引起氧化应激反应，导致细胞损伤。线粒体通过氧化呼吸链的电子漏还原氧分子形成线粒体来源活性氧簇（mitochondria-derived reactive oxygen species，mitoROS），是机体ROS 的主要来源，同时也是ROS 主要攻击的靶点，两者导致的恶性循环进一步加剧组织的损伤［9］。研究［10-11］显示：心肌细胞和海马神经元细胞等在尼古丁刺激下，细胞中线粒体受损，产生大量mitoROS，引发线粒体功能障碍，激活线粒体途径的细胞凋亡，导致组织细胞损伤。研究［12］证实：线粒体氧化应激及功能障碍在氯化钴诱导人牙周膜干细胞凋亡中发挥关键作用，应用ROS 清除剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC） 可缓解上述细胞损伤，但目前尚无关于线粒体氧化应激在尼古丁诱导成骨细胞凋亡中作用的相关报道。本研究拟通过体外细胞模型实验观察ROS 清除剂NAC 对尼古丁诱导MC3T3-E1 细胞凋亡的影响，探讨其可能的作用机制，为吸烟相关牙周炎患者的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1 细胞（美国ATCC 细胞库）。胎牛血清（美国Gibco 公司），高糖培养基、 0.25% 胰酶和青/链霉素（美国Hyclone 公司），噻唑蓝（MTT）和NAC （美国Sigma 公司），Annexin Ⅴ-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（美国BD 公司），蛋白裂解液和BCA 蛋白定量检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），B 细胞淋巴瘤2 （B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、 Bcl-2 相 关X 蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax） 和β-肌动蛋白（β-actin） 抗体（美国CST 公司），MitoSOX Red 荧光测定试剂盒、山羊抗鼠二抗和山羊抗兔二抗（美国Invitrogen 公司）。凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad 公司），荧光显微镜（德国Leica 公司），低温高速离心机和流式细胞仪（美国Beckman 公司）。

1.2 MC3T3-E1 细胞的培养将复苏的MC3T3-E1 细胞置于含10% 胎牛血清和1% 双抗（青/链霉素） 的α-MEM 培养基中，并在5% CO2、37 ℃饱和湿度培养箱中培养，每3 d 传代1 次，选取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3 MTT 法检测MC3T3-E1 细胞增殖活性将MC3T3-E1 细胞以5×104mL－1密度接种于96 孔细胞培养板24 h 后，用不同浓度（0、 1.0、 2.5、5.0 和7.5 mmol·L－1） 尼古丁处理细胞24 h，弃上清，每孔加入100 μL 无血清培养基和20 μL MTT工作液，置于5% CO2、37 ℃和饱和湿度培养箱中培养4 h，采用酶标仪在490 nm 波长处检测各孔吸光度（A） 值，根据公式计算细胞增殖活性。细胞增殖活性=（实验孔A 值－空白孔A 值） /（对照孔A 值－空白孔A 值） ×100%。计算尼古丁半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50） 值。进一步依据尼古丁的IC50 值，将MC3T3-E1 细胞分为对照组、 尼古丁（ 4.25 mmol·L－1） 组和尼古丁（4.25 mmol·L－1） +不同浓度NAC （2.5、 5.0 和7.5 mmol·L－1） 组，处理细胞24 h 后，检测各组细胞A 值，计算各组细胞增殖活性，确定NAC 最适作用浓度应用于后续实验。每组实验均重复3次。

1.4 MitoSOX 荧光染色法检测各组细胞中mitoROS 水平将MC3T3-E1 细胞以5×104mL－1密度接种于48 孔细胞培养板，分为对照组、尼古丁（4.25 mmol·L－1） 组、 NAC （5.0 mmol·L－1）组和尼古丁（4.25 mmol·L－1） +NAC（5.0 mmol·L－1） 组，每组3 个复孔，培养24 h后，弃原培养基，PBS 缓冲液洗涤细胞1 次后，加入终浓度100 nmol·L－1MitoSOX，37 ℃避光孵育15 min，PBS 缓冲液洗涤后利用荧光显微镜观察并拍照，采用Image J 软件计算各组细胞平均荧光强度，以各组细胞荧光强度代表mitoROS 水平。每组实验均重复3次。

1.5 流式细胞术检测各组细胞凋亡率将MC3T3-E1 细胞以5×104mL－1密度接种于6 孔细胞培养板，细胞分组同“ 1.4”，每组3 个复孔，24 h 后，用不含EDTA 胰酶消化收集各组细胞，1 000 r·min－1离心5 min，弃上清，预冷PBS 缓冲液洗涤细胞2 次，离心后加入含AnnexinⅤ-FITC和PI 染液的Binding buffer 缓冲液混悬细胞，避光孵育10 min，上机检测，并计算各组细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/（凋亡细胞数+正常细胞数） ×100%。每组实验均重复3次。

1.6 Western blotting 法检测各组细胞中Bax 和Bcl-2 蛋白表达水平将MC3T3-E1 细胞以5×104mL－1密度接种于6 孔细胞培养板，细胞分组同“1.4”，每组3 个复孔，24 h 后收集各组细胞，采用蛋白裂解液裂解提取细胞总蛋白，BCA 法进行蛋白定量检测后，煮沸变性。经过10% SDSPAGE 电泳、转膜、 5% 脱脂牛奶室温摇床封闭1 h，1×TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入相应一抗，4 ℃孵育过夜。回收一抗，1×TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入二抗室温孵育1 h，用ECL检测液发光显影定影后，采用凝胶成像仪对各组MC3T3-E1 细胞中目的蛋白条带灰度值进行分析。目的蛋白表达水平以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值比值表示，同时计算Bax/Bcl-2 比值。

1.7 统计学分析采用Graphpad Prism 6.0 统计软件进行统计学分析。各组细胞增殖活性、细胞中mitoROS 水平、细胞凋亡率和细胞中Bax/Bcl-2 比值均符合正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组MC3T3-E1细胞增殖活性与0 mmol·L－1尼古丁组比较，1.0、 2.5、 5.0 和7.5 mmol·L－1尼古丁组MC3T3-E1 细胞增殖活性明显降低（P＜0.05），并呈浓度依赖性，尼古丁的IC50值为（4.25±0.03） mmol·L－1。与对照组比较，尼古丁组细胞增殖活性明显降低（P＜0.05）；与尼古丁组比较，尼古丁+2.5、5.0 和7.5 mmol·L－1NAC组MC3T3-E1 细胞增殖活性明显升高（P＜0.05），以尼古丁+5.0 mmol·L－1NAC 组细胞增殖活性升高最为明显。故采用4.25 mmol·L－1尼古丁和5.0 mmol·L－1NAC 进行后续实验。见图1。

图1 不同浓度尼古丁(A) 和NAC（B）处理后各组细胞增殖活性Fig.1 Proliferation activities of MC3T3-E1 cells after treated with different concentrations of nicotine(A) and NAC（B）

2.2 各组细胞中mitoROS 水平与对照组比较，尼古丁组细胞中mitoROS 水平明显升高（P＜0.05）；与尼古丁组比较，NAC 组和尼古丁+NAC组细胞中mitoROS 水平明显降低（P＜0.05）。见图2 和3。

图2 各组MC3T3-E1 细胞MitoSOX 荧光染色情况（×200）Fig.2 MitoSOX fluorescence staining of MC3T3-E1 cells in various groups(×200)

图3 各组细胞中mitoROS 水平Fig.3 MitoROS levels in cells in various groups

2.3 各组细胞凋亡率对照组、尼古丁组、NAC组和尼古丁+NAC 组细胞凋亡率分别为（2.10±0.01） % 、（10.60±0.66） % 、（2.85±0.24） %和（6.90±0.48） %。与对照组比较，尼古丁组细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；与尼古丁组比较，NAC 组和尼古丁+NAC 组细胞凋亡率明显降低（P＜0.05），但尼古丁+NAC 组细胞凋亡率仍高于对照组（P＜0.05）。见图4。

图4 流式细胞术检测各组细胞凋亡率Fig.4 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

2.4 各组细胞中Bax/Bcl-2 比值与对照组（1.293+0.035） 比较，尼古丁组细胞中Bax/Bcl-2比值（1.544+0.123） 升高（P＜0.05）； 与尼古丁组比较，尼古丁+NAC 组细胞中Bax/Bcl-2 比值（1.19+0.03） 降低（P＜0.05）。见图5。

图5 各组细胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表达电泳图Fig.5 Electrophoregram of expressions of Bcl-2 and Bax proteins in cells in various groups

3 讨 论

目前我国总吸烟人数已超过3.12 亿，流行病学研究［13-16］显示：吸烟人群牙周炎患病率是非吸烟人群的4 倍，并伴牙周组织破坏加重和治疗效果和预后差等特点。研究［17-18］证实：尼古丁作为烟草中主要的毒性成分，可通过沉积在牙齿和牙槽骨表面，直接促进牙槽骨吸收；间接进入血液循环系统，通过增加氧化应激反应、 激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB） 信号通路、升高NF- κB 受体配体激活因子（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）/骨保护素（osteoprotegerin，OPG） 水平及释放大量炎症介质等破坏机体骨组织稳态。其次，研究［19］显示：电子烟（也称尼古丁传送系统） 作为新型烟草制品其尼古丁含量高达320.5 mmol·L－1，其使用率在全世界呈流行趋势，在青少年人群中的增长尤为明显，极大危害青少年的牙周及全身健康，因此研究尼古丁在调控机体骨稳态中的作用具有重要意义。

研究［20］证实：在吸烟者唾液和血液中尼古丁浓度分别可高达9.6 和1.2 mmol·L－1，而0～10 mmol·L－1尼古丁可呈浓度依赖性诱导人牙周膜细胞凋亡，抑制成骨细胞分化，促进破骨细胞形成，释放炎症介质，破坏骨代谢平衡，参与牙周组织骨破坏。牙周膜细胞是具有成纤维及成骨分化等多项潜能的细胞群，在维持牙周软、硬组织骨稳态中发挥重要作用。本研究结果显示：尼古丁可呈浓度依赖性抑制前成骨细胞（MC3T3-E1 细胞） 增殖活性，并促进细胞凋亡，导致细胞损伤。

牙周炎发病机制复杂，成骨细胞凋亡水平与牙周炎骨破坏有密切关联，而线粒体氧化应激与细胞内各种凋亡信号密切相关［21-22］。研究［23］表明：尼古丁可呈浓度依赖性激活细胞中ROS，促进人牙龈成纤维细胞凋亡，抑制牙龈组织自我修复能力；尼古丁可通过诱导细胞内H2O2生成，增加促凋亡蛋白甲基乙二醛水平，促进人成骨细胞凋亡，参与骨质疏松症的发生发展［24］；3 mmol·L－1以上尼古丁可引起大鼠牙龈成纤维细胞内线粒体肿胀和空泡化［25］。为研究线粒体氧化应激在尼古丁诱发成骨细胞凋亡中的作用，本研究采用MitoSOX 荧光探针检测细胞中mitoROS 水平，结果表明：4.25 mmol·L－1尼古丁可明显增加MC3T3-E1 细胞中mitoROS 水平。NAC 是一种含巯基的还原剂，可通过促进细胞中谷胱甘肽的合成，清除ROS，发挥抗氧化应激保护细胞的作用［26］。本研究进一步应用NAC 处理MC3T3-E1 细胞，结果显示：NAC 不仅可缓解尼古丁诱导的细胞增殖抑制作用，还可明显降低尼古丁诱导的MC3T3-E1 细胞中mitoROS 水平、细胞凋亡率和凋亡相关蛋白表达水平的升高。研究［9］显示：线粒体氧化应激水平的增高往往伴随线粒体功能障碍如线粒体肿胀、膜电位下降、ATP 衰竭和呼吸链受损，导致细胞色素C和内外膜间促凋亡因子的释放，进而激活线粒体途径细胞凋亡。本研究结果表明：线粒体氧化应激参与尼古丁诱导的MC3T3-E1 细胞凋亡过程，NAC可逆转上述损伤，然而线粒体功能障碍是否参与尼古丁介导的成骨细胞氧化应激损伤和细胞凋亡尚需进一步研究。

综上所述，本研究从线粒体分子生物学层面阐释了尼古丁在诱导成骨细胞凋亡中的作用，并探讨了其可能的分子生物学机制，为吸烟相关牙周炎防治提供了新的靶点和思路。