北五味子乙素对大鼠心脏成纤维细胞增殖的抑制作用及其PI3K/Akt/P27kip1 信号通路机制

刘春旭, 孙红霞, 胡 波, 姜恩平

（1.北华大学药学院药理教研室，吉林 吉林 132013；2.北华大学附属医院呼吸科，吉林 吉林 132011；3.广东医科大学基础医学院病理教研室，广东 东莞 523808）

以心脏成纤维细胞（cardiac fibroblast，CFb）增殖和胶原过度沉积为特征的心脏间质重构是心肌纤维化发生的主要因素。血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ） 作用于CFb 上的血管紧张素Ⅰ型受体，通过激活一系列细胞信号通路导致心肌纤维化［1-2］。研究［3-4］显示：作为经典的信号通路，磷酯酰肌醇3- 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K） /蛋白激酶B （protein kinase B，即Akt） 在细胞增殖、迁移、分化和血管生成等方面发挥重要作用，并参与肺、肝脏、肾脏和胰腺等多种器官的纤维化过程。采用醛固酮、AngⅡ和他汀类药物干预CFb 的实验［5］结果显示：PI3K/Akt 信号通路参与其病理生理过程。P27kip1 蛋白作为细胞周期的负性调节因子能影响细胞周期的变化，研究［6-7］显示：P27 （P27kip1） 在左室肥厚中起重要作用并参与心血管细胞信号通路调节。五味子乙素（Schisandrin，SchB） 是北五味子中含量最高的联苯环辛烯类木脂素，五味子具有收敛固涩、益气养津和安神宁心等诸多药理学作用［8］。本实验室前期研究［9］结果表明： SchB 具有抑制CFb 增殖和胶原蛋白分泌作用。本研究通过在细胞水平上观察SchB 对AngⅡ诱导的CFb 增殖、细胞周期和Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、PI3K、Akt 及P27kip1 蛋白表达的影响，以阐明其是否通过PI3K/Akt/P27kip1 信号转导通路拮抗AngⅡ诱导CFb 的增殖作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器出生1～3 d 的SD 大鼠乳鼠，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供，动物生产许可证号： SCXK- （ 吉）2007-0003。SchB （成都埃法生物科技有限公司，批号：61281-37-6），胰蛋白酶购自杭州浦泰生物科技有限公司，胎牛血清购自美国Gibco 公司，AngⅡ和四氮唑盐（MTT） 购自美国Sigma 公司，PI3K 抑制剂LY249002、化学发光试剂盒（ECL）和PI3K、 Akt、 磷酸化Akt （phosphorylation Akt，p-Akt） 及P27kip1 单克隆抗体购自赛默飞世尔科技公司，IMDM 培养基购自美国Hyclone 公司。MCO-18AIC CO2培养箱购自日本松下公司，酶标仪购自瑞士TECAN 公司，CX33 倒置显微镜购自日本Olympus 公司，Attune NxT 流式细胞仪购自美国Invitrogen 公司，超净工作台购自山东博科生物产业有限公司。

1.2 细胞培养取出生1～3 d 的SD 大鼠心室组织，胰酶消化，收集细胞，置于含100 mL·L－1胎牛血清的IMDM 培养基中，在5% CO2、37 ℃及饱和湿度条件下培养60～90 min。采用差速贴壁法，分离CFb，加入含100 mL·L－1胎牛血清的IMDM培养基继续培养。经倒置显微镜、透射电镜和免疫组织化学染色检测，纤维连接蛋白染色阳性和α - 平滑肌肌动蛋白染色阴性，鉴定为所需的CFb，纯度达98%，生长近融合时按1∶3 传代，实验采用2～4 代细胞。

1.3 实验分组细胞分为5 组。对照组：IMDM培养基不加药物；模型组：培养基中加入终浓度为0.1 μmol·L－1的AngⅡ； LY294002 组： 培养基中加入0.1 μmo·L－1AngⅡ和10 μmol·L－1LY294002；SchB 组：培养基中同时加入10 μmol·L－1SchB 和0.1 μmol·L－1AngⅡ；LY294002+SchB 组：培养液 中 加 入0.1 μmol·L－1Ang Ⅱ、 10 μmol·L－1LY294002 （ AngⅡ刺 激 前30 min 给 药） 和10 μmol·L－1SchB。

1.4 MTT 比色法检测各组CFb 增殖抑制率各组细胞接种于96 孔细胞培养板，每组8 复孔，药物干预24 h，于培养结束前4 h，加入5 g·L－1MTT 10 μL，待形成蓝紫色的结晶沉淀后加入DMSO 150 μL 使沉淀降解，采用酶联免疫检测仪于490 nm 波长处测定吸光度（A） 值，采用只加培养液不加细胞的空白孔调零；根据各实验组的A 值计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=［1－ （实验孔A 值－空白孔A 值） /（对照孔A 值－空白孔A 值）］ ×100%。

1.5 流式细胞术检测各组不同细胞周期CFb 百分率作用24 h 后，收集各组细胞，－20 ℃、70%乙醇过夜后，冰浴，离心，重悬于PBS 缓冲液，取适量细胞悬液加入RNA 酶，37 ℃水浴30 min，加入碘化丙啶染液，暗处冰浴30 min。上机前采用300 目尼龙网过滤。根据碘化丙啶所标记的DNA含量确定细胞所处的周期。计算不同细胞周期CFb胞百分率。以增殖指数（proliferation index，PI）表示CFb 的增殖活性，计算公式：PI=（S+G2/M） /（G0/G1+S+G2/M） ×100%。采用Cell Quest 软件获取数据，采用Modifit LT 软件进行细胞周期分析。

1.6 免疫细胞化学染色法检测各组CFb 中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达水平将传代培养的CFb放入预先放置有几张7 mm×7 mm 盖玻片的24 孔细胞培养板中培养。各种处理因素作用24 h 后，将生长有CFb 的盖玻片取出后采用PBS 缓冲液洗涤2 次，冷丙酮固定10 min，晾干后用中性树脂固定于载玻片上。采用SP 法进行免疫细胞化学染色。阳性反应呈棕黄色细密颗粒，阴性对照采用PBS缓冲液取代一抗染色为阴性。采用全自动图像分析仪，在每组随机选择4～6 个高倍视野自动计数约100 个细胞，采用Media Cybernetics 公司的Image-ProPlus 5.0 图像分析软件分析各组CFb 中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达的平均A 值，以平均A 值代表Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达水平。

1.7 Western blotting 法检测各组CFb 中PI3K、Akt、p-Akt 和P27kip1 蛋白表达水平各处理因素分别作用于24 h 后，收集各组细胞，蛋白提取采用12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，100 V 、20 mA 电转移2 h，将蛋白转移至PVDF 膜上，5%BSA 封闭2 h，加入1∶1 000 稀释的小鼠抗大鼠PI3K、p-Akt/Akt 和P27kip1 单克隆抗体（一抗），4 ℃孵育过夜，用1∶200 稀释的HRP 标记的羊抗鼠IgG 抗体（二抗），室温孵育2 h，洗膜，ECL 曝光显影，显色后采用凝胶成像系统进行灰度值分析，以各目的蛋白条带灰度值与β-actin 条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。实验重复3 次。

1.8 统计学分析采用SPSS 23.0 统计软件进行统计学分析。各组CFb 增殖抑制率，不同细胞周期CFb 百分率和PI，各组CFb 中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、PI3K、Akt、p-Akt 和P27kip1 蛋白表达水平经正态性检验均符合正态分布，以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组CFb 增殖抑制率与对照组比较，模型组细胞增殖抑制率明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，LY294002 组、 SchB 组和LY294002+SchB 组细胞增殖抑制率明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。见表1。

表1 各组CFb 增殖抑制率Fig.1 Inhibitory rates of proliferation of CFb in various groups （n=7，±s）

表1 各组CFb 增殖抑制率Fig.1 Inhibitory rates of proliferation of CFb in various groups （n=7，±s）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model LY294002 SchB LY294002+SchB Inhibitory rate of proliferation（η/%）0 53.56±7.32*33.70±5.28△29.74±4.77△48.27±5.39△△

2.2 各组不同细胞周期CFb 百分率和PI与对照组比较，模型组G0/G1期CFb 百分率明显降低（P＜0.01），S 期CFb 百分率和PI 明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，LY294002 组、SchB 组和LY294002+SchB 组G0/G1期CFb 百分率明显升高（P＜0.05 或P＜0.01），S 期CFb 百分率和PI 明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）； 与LY294002 组比较，LY294002+SchB 组G0/G1期CFb 百分率明显升高（P＜0.05），S 期CFb 百分率和PI 明显降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组不同细胞周期CFb 百分率和PITab.2 Percentages of CFb at different cell cycles and PI in various groups （n=7，±s，η/%）

表2 各组不同细胞周期CFb 百分率和PITab.2 Percentages of CFb at different cell cycles and PI in various groups （n=7，±s，η/%）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group；＃P＜0.05 compared with LY294002 group.

G r o u p C o n t r o l M o d e l L Y 2 9 4 0 0 2 S c h B L Y 2 9 4 0 0 2+S c h B P e r c e n t a g e o f C F b G 0/G 1 8 3.2±3.6 7 3.6±7.4*7 8.4±3.2△8 5.1±2.6△△9 2.7±4.7△△#S 1 0.4±3.2 2 0.7±6.5*1 5.8±2.5△1 2.3±2.6△5.3±1.8△△＃G 2/M 6.5±1.6 5.7±1.9 5.8±2.3 2.6±2.3 2.0±3.2 P I 1 6.8±3.8 2 6.4±4.2*2 1.6±4.3△1 4.9±4.2△7.3±3.1△△#

2.3 各组CFb 中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达水平与对照组比较，模型组CFb 中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，LY294002 组、 SchB 组和LY294002+SchB 组CFb 中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）；与LY294002 组比较，LY294002+SchB 组CFb 中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。见表3和图1。

图1 免疫细胞化学染色法检测各组CFb 中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达情况(×400)Fig.1 Expressions of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen proteins in CFb in various groups detected by immunocytochemical staining method (×400)

表3 各组CFb 中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of typeⅠcollagen and typeⅢcollagen proteins in CFb in various groups （n=7，±s）

表3 各组CFb 中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of typeⅠcollagen and typeⅢcollagen proteins in CFb in various groups （n=7，±s）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group；＃P＜0.05 compared with LY294002 group.

Group Control Model LY294002 SchB LY294002+SchB TypeⅠcollagen 0.66±0.13 1.57±0.15*0.83±0.19△0.68±0.07△△0.47±0.06△△＃Type Ⅲcollagen 0.59±0.08 1.29±0.14*0.53±0.17△0.47±0.04△△0.37±0.05△△＃

2.4 各组CFb 中PI3K、Akt、p-Akt 和P27kip1 蛋白表达水平与对照组比较，模型组CFb 中PI3K 和p-AKT 蛋 白 表达 水 平 明显 升 高（P＜0.01），P27kip1 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，LY294002 组、SchB 组和LY294002+SchB 组CFb 中PI3K 和p-Akt 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），P27kip1 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）；与LY294002 组比较，LY294002+SchB 组CFb 中PI3K 和p-Akt 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），P27kip1 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。各组CFb 中Akt 蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 Western blotting 法检测各组细胞中PI3K、Akt、p-Akt 及P27kip1 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B－D）Fig.2 Electrophoregram(A) and histogram(B-D) of expressions of PI3K,Akt,p-Akt and P27kip1 proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

3 讨 论

心肌纤维化以CFb 转化为肌成纤维细胞进而过度增殖和胶原蛋白分泌增加为主要特征，并参与心室重塑。在众多促CFb 增殖信号通路中，PI3K/Akt 发挥重要作用。研究［10-13］显示：PI3K/Akt 信号通路参与AngⅡ、转化生长因子和阿霉素等所致的心肌肥厚和纤维化过程。本研究结果显示：正常状态下，CFb 中PI3K 和Akt 表达水平相对较低，经AngⅡ诱导后，PI3K 和p-Akt 表达水平明显升高，采用PI3K 抑制剂LY294002 作用后，PI3K/Akt 蛋白表达水平明显降低，下游纤维化指标Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达水平明显降低，同时CFb的增殖、迁移和转化受到抑制，提示PI3K/Akt 信号通路介导并参与了AngⅡ诱导CFb 增殖过程［5］。

P27 蛋白是细胞周期负性调节因子，通过调控G1/S 期调控点阻滞细胞于G0/G1期，从而抑制细胞增殖［7，14-15］。有文献［7，16-20］报道： P27kip1 上调在AngⅡ诱导的心血管细胞肥大中起重要作用，AngⅡ通过激活PI3K 和信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STATs） 等信使分子，进而控制下游一系列蛋白酶的激活和失活，抑制P27kip1 蛋白的合成，加速其降解，使P27kip1 蛋白表达水平降低，细胞得以通过G1/S 限制点进入S 期，完成分裂增殖过程。

SchB 是五味子中含量较高的活性单体成分之一，本课题组前期研究［21-22］显示：SchB 具有镇静催眠、清除氧自由基、抗氧化抗衰老和降脂保肝等诸多药理学作用，同时SchB 也能抑制AngⅡ诱导的CFb 增殖，但有关作用机制尤其是信号通路报道较少。本研究结果显示：与模型组比较，PI3K抑制剂LY294002 能明显抑制AngⅡ促使的CFb 增殖和Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维分泌，降低PI3K和p-Akt蛋白表达，上调P27kip1 蛋白表达，调控细胞周期使细胞增殖受阻，表明AngⅡ诱导CFb 增殖作用是通过激活PI3K/AKT/P27 信号通路实现的；SchB 组CFb 增殖受到抑制，胶原蛋白分泌减少，PI3K 和p-Akt 蛋白表达水平降低，P27kip1 蛋白表达水平升高，说明SchB 能够通过抑制PI3K/Akt 信号通路，提高下游信号分子P27kip1 表达，抑制CFb 增殖和胶原的沉积；LY294002 与SchB 共同作用后，可使AngⅡ刺激下的CFb 增殖进一步降低，同时胶原表达水平明显下降，细胞周期G0/G1期细胞百分率明显升高，S 期细胞百分率明显降低，说明上述阻断作用进一步加强，但与对照组比较，各项指标未恢复到正常水平。本研究中，与LY294002 组比较，LY294002+SchB 组PI3K、 p-Akt 和P27kip1 蛋白表达水平差异均有统计学意义，表明在LY294002基础上，SchB 可能通过其他途径阻断PI3K/Akt 通路的激活，也可能是SchB 与LY294002 协同通过阻断PI3K 和Akt 蛋白表达从而抑制Ang Ⅱ诱导CFb 增殖和胶原分泌作用，表明细胞中PI3K 和Akt 活性受到抑制后，AngⅡ诱导的CFb 增殖受阻；与模型组比较，LY294002 组和SchB 组细胞中PI3K 和Akt 蛋白表达水平虽有不同程度降低，但与对照组比较，各项指标未降到正常水平。本研究结果提示：SchB 只是部分阻断PI3K/Akt 通路的激活，除PI3K/Akt 参与AngⅡ促CFb 增殖过程外，可能还有其他的通路存在［23-26］。

综上所述，AngⅡ通过作用于CFb 的AT1 受体，激活PI3K/Akt 通路，抑制下游信号分子P27kip1 蛋白表达，促进CFb 增殖和胶原合成，诱导心肌纤维化的发生。SchB 通过部分抑制PI3K/Akt 通路的激活，提升P27kip1 蛋白表达水平，降低CFb 增殖和胶原蛋白的合成及分泌，拮抗AngⅡ的部分生物活性，通过阻断PI3K/Akt 信号通路及调控P27kip1 蛋白表达使细胞周期停滞于静止期，使细胞增殖受阻，从而抑制心肌纤维化的发生。