雷公藤多苷抑制PI3K/AKT信号通路对肺腺癌细胞迁移和血管形成的影响

马春兰，张宝亮，刘晓明

肺癌是全球常见恶性肿瘤，其发病率、病死率均居恶性肿瘤首位，5年生存率总体偏低，仅17.9%左右，严重影响病人健康，给其家庭带来沉重负担[1-2]。有研究表明，非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinomas，NSCLC）是肺癌主要类型，早期临床表现不典型，确诊时往往已到中晚期，手术治疗、放化疗效果欠佳，易引发不良反应[3-4]。肺腺癌作为NSCLC的主要病理类型之一，早期即可侵犯淋巴管、血管并发生转移，由于确诊往往较晚，多数只能选择放化疗和药物治疗等手段[5]。因此，寻找有效的抗肿瘤药物对于治疗肺腺癌具有重要价值。雷公藤多苷（tripterygium wilfordii polyglycosidium，TWP）是雷公藤提取物，由于具有抗炎功效，既往常用于治疗炎症性疾病，近来有研究表明，其在口腔癌等肿瘤疾病治疗中亦能发挥不错的效果[6-7]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/（protein kinase B，AKT）通路是重要信号转导途径，可通过联系致癌基因与其受体，在癌细胞增殖、凋亡过程中扮演重要角色[8]。但目前TWP对肺腺癌及PI3K/AKT信号通路的影响少有报道。本研究自2019年6―12月通过研究TWP对肺腺癌细胞株A549增殖、凋亡、迁移、血管生成及PI3K/AKT信号通路的影响，以期为TWP治疗的肺腺癌临床应用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 主要的试剂与仪器肺腺癌细胞株A549、静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）购自上海冠导生物工程公司，货号GDCs019499、C4601；TWP购自上海经科化学科技公司，货号JKBw1779；CCK-8试剂、凋亡检测试剂盒、结晶紫购自北京百奥莱博科技有限公司，货号QN1293-OIR、WE0325-THR、GL0942-PYK；蛋白提取试剂盒、BCA蛋白试剂盒、磷酸化AKT（p-AKT）抗体、AKT抗体、PI3K抗体、磷酸化PI3K（p-PI3K）抗体、GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔购自上海恒斐生物科技有限公司，货号BC3640、PT0001、bs-5194R-2、bs-0115R-2、bs-0128R-2、bs-5538R-2、M1000110、SR134；RPMI-1640培养基、化学发光试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司，货号ZY-3291R、ZY-11256；酶标仪为美国Molecular Devices产品，型号：SpectraMax®iD5；流式细胞仪为美国BD产品，型号BD FACSCanto Ⅱ；显微镜为上海炳宇光学仪器公司产品，型号XDS-10；化学发光成像系统为美国Bio-Rad公司，型号ChemiDocXRS。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 A549细胞培养在RPMI-1640培养基（加胎牛血清）中，放培养箱37℃、5%二氧化碳常规培养，细胞贴壁融合到80%左右，消化并传代培养。

1.2.2 CCK-8法检测A549细胞增殖情况 将1×105个/毫升A549细胞每孔以100 μL接种于96孔培养板，培养24 h后加入TWP处理，使其终浓度分别为0 μmol/L（0 μmol/L TWP 组）、20 μmol/L（20 μmol/L TWP组）、40 μmol/L（40 μmol/L TWP组）、80 μmol/L（80 μmol/L TWP组），培养后（24、48、72 h）每孔加CCK-8 10 μL，孵育5 h，酶标仪（450 nm）测各孔吸光度（optical density，OD）值，并计算细胞增殖抑制率。

1.2.3 流式细胞仪测A549细胞凋亡情况 A549细胞按1.2.2分组处理，培养48 h收集，消化、洗涤后，按照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书步骤加400 μL 1×结合缓冲液，调整为 1×106个/毫升，加Annexin V-FITC、PI各5 μL，黑暗处孵育20 min，用流式细胞仪进行A549细胞凋亡率检测。

1.2.4 Transwell法测A549细胞迁移情况 以1×105个/孔的密度将对数期A549细胞接种于Transwell小室上层，加无血清培养液于上室，加含血清培养液（20%，500 μL）于下室，培养24 h后，未穿膜细胞擦去，乙醇（95%）固定5 min，加结晶紫染色，20 min后PBS洗涤，用显微镜统计6个随机视野下穿膜细胞数量，取平均值。

1.2.5 Matrigel胶小管形成实验检测血管生成 将96孔培养板、无菌移液枪头等所有实验中将接触MatrigelTM基质胶的器材放置在−20℃冰箱中预冷，-20℃保存的MatrigelTM基质胶于4℃冰箱中解冻，待基质胶呈液态时向培养板每孔加入60 μL，再置于4℃10 min，常规30 min成胶。按1.2.2分组处理A549细胞，培养24 h后收集各组A549细胞培养上清液。将1×105个/毫升HUVEC单细胞悬液以每孔100 μL的体积接种于96孔培养板，分别加入200 μL A549细胞培养上清液，加200 μL RPMI-1640培养液于对照组，细胞培养箱中培养24 h。使用显微镜观察类血管结构形成情况并拍照记录，使用Image-Pro Plus软件分析成管数量。

1.2.6 蛋白质印迹法（Western blotting）测A549细胞中PI3K/AKT通路蛋白表达情况 A549细胞按1.2.2分组处理，培养48 h后收集。蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA蛋白试剂盒进行定量，然后将蛋白样品电泳分离、转膜、封闭，分别加入p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT和内参GAPDH的抗体（1∶500），4℃孵育过夜，洗涤，加入二抗（羊抗兔，用辣根过氧化物酶标记，1∶5 000），孵育2 h，化学发光显色，胶片扫描，Tanon 600系统分析条带灰度值。

1.3 统计学方法采用SPSS 24.0统计学软件处理数据，计量资料以±s表示，多组间采用单因素方差分析进行比较，采用LSD-t检验进一步两两比较。当P<0.05时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TWP对A549细胞增殖的影响随着A549细胞培养时间延长，0 μmol/L TWP组各时间点A549细胞增殖抑制率比较，差异无统计学意义（P>0.05），20、40、80 μmol/L TWP组 A549细胞增殖抑制率升高（P<0.05）。同一时间点，随着TWP浓度的升高，A549细胞的增殖抑制率均升高（P<0.05）。见表1。

表1 不同细胞培养时间不同浓度TWP组A549细胞增殖抑制率比较/±s

表1 不同细胞培养时间不同浓度TWP组A549细胞增殖抑制率比较/±s

注：①与0 μmol/L TWP组相比，P<0.05。②与20 μmol/L TWP组相比，P<0.05。③与40 μmol/L TWP组相比，P<0.05。④与24 h相比，P<0.05。⑤与48 h相比，P<0.05。

72 h组别重复次数细胞增殖抑制率/%24 h 48 h 0 μmol/L TWP组20 μmol/L TWP组40 μmol/L TWP组80 μmol/L TWP组F值P值0.00±0.00 13.66±1.08①④⑤21.27±1.85①②④⑤24.63±2.26①②③④⑤246.69<0.001 5 5 5 1 51 0.00±0.000.00±0.00 9.96±0.85①11.43±0.92①④2.77±0.98①②7.21±1.13①②③359.61<0.001 15.84±1.08①②④20.75±1.44①②③④384.42<0.001

2.2 TWP对A549细胞凋亡、迁移的影响随着TWP浓度的升高，A549细胞的凋亡率均显著升高，穿膜细胞数均显著降低（P<0.05）。见图1，表2。

图1 A549细胞迁移：A为0 μmol/L TWP组；B为20 μmol/L TWP组；C为40 μmol/L TWP组；D为80 μmol/L TWP组

表2 不同浓度雷公藤多苷（TWP）组A549细胞凋亡率及穿膜细胞数比较/±s

表2 不同浓度雷公藤多苷（TWP）组A549细胞凋亡率及穿膜细胞数比较/±s

注：①与0 μmol/L TWP组相比，P<0.05。②与20 μmol/L TWP组相比，P<0.05。③与40 μmol/L TWP组相比，P<0.05。

9组别0 μmol/L TWP组20 μmol/L TWP组40 μmol/L TWP组80 μmol/L TWP组F值P值重复次数5 5 5 5细胞凋亡率/%5.56±0.84 8.78±0.69①10.36±1.13①②21.68±2.11①②③142.367<0.001穿膜细胞数/个176.64±41.26 122.08±30.72①83.34±19.75①②43.58±13.29①②③20.040<0.001

2.3 TWP对A549细胞诱导血管生成的影响与对照组相比，0、20、40、80 μmol/L TWP组A549细胞诱导 HUVEC 成管数量均升高[（35.85±8.72）、（24.13±6.86）、（15.34±4.66）、（9.15±2.25）个比（6.31±1.49）个，P<0.05]；随着TWP浓度升高，A549细胞诱导HUVEC成管数量均降低（P<0.05）。见图2。

图2 雷公藤多苷（TWP）对A549细胞诱导血管生成的影响：A为对照组；B为0 μmol/L TWP组；C为20 μmol/L TWP组；D为40 μmol/L TWP组；E为80 μmol/L TWP组

2.4 TWP对A549细胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达的影响随着TWP浓度升高，A549细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值均显著降低（P<0.05）。见图3、表3。

图3 雷公藤多苷（TWP）对A549细胞中磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶B（AKT）、p-AKT蛋白表达的影响

表3 不同浓度雷公藤多苷（TWP）组A549细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值比较/±s

表3 不同浓度雷公藤多苷（TWP）组A549细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值比较/±s

注：①与0 μmol/L TWP组相比，P<0.05。②与20 μmol/L TWP组相比，P<0.05。③与40 μmol/L TWP组相比，P<0.05。

p-AKT/AKT 0.74±0.14 0.53±0.14①0.35±0.09①②0.21±0.05①②③21.135<0.001组别0 μmol/L TWP组20 μmol/L TWP组40 μmol/L TWP组80 μmol/L TWP组F值P值重复次数5 5 5 5 p-PI3K/PI3K 0.98±0.16 0.76±0.13①0.55±0.12①②0.36±0.09①②③21.997<0.001

3 讨论

中药治疗恶性肿瘤具有多靶点、多方位、不易产生耐药性等优势，目前已成为研究新的抗肿瘤药物的重要方向[9]。中药雷公藤是卫矛科植物雷公藤的根，具有多种抑制免疫、抗炎、抗肿瘤的有效成分，虽然在临床应用上发生中毒事件较多，但在肿瘤治疗研究中仍有很高的应用前景[10]。而TWP是一种脂溶性混合物，从雷公藤中提取，在保留抑制免疫、抗肿瘤等功能的同时，去除了许多毒性成分[11]。增殖、凋亡异常和细胞迁移是肿瘤细胞的基本特征，抑制肿瘤细胞异常增殖、迁移和促进凋亡是评价抗肿瘤药物的重要指标[12]。厉婷等[7]研究表明，TWP可能通过激活PI3K/AKT信号通路来抑制口腔癌KB细胞增殖并促进其凋亡，在口腔癌的治疗中可能发挥作用。本研究结果显示，20、40、80 μmol/L TWP组A549细胞增殖抑制率均随培养时间延长而显著升高，同一时间点，A549细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均随TWP浓度升高而显著升高，A549细胞穿膜细胞数随TWP浓度升高而显著降低，表明TWP能抑制A549细胞增殖、迁移并促进其凋亡，该作用随TWP浓度升高而增强。

肿瘤生长转移与新生血管生成密切相关，当肿瘤体积超过2 mm3，通过分泌各种促血管生成因子在周围形成新的血管网，以保证肿瘤内部不会因缺血、缺氧而坏死[13]。因此，抑制肿瘤血管生成的药物已成为如今抗肿瘤药物研发的热点之一。本研究结果显示，与对照组相比，0 μmol/L TWP组A549细胞诱导HUVEC成管数量较对照组显著升高，A549细胞诱导HUVEC成管数量随TWP浓度升高均显著降低，表明A549细胞具有诱导血管生成的作用，而TWP在A549细胞诱导血管生成过程中具有抑制作用，且随TWP浓度是升高，该作用不断增强。

PI3K/AKT通路是调控肿瘤进展的重要通路，与肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移及血管生成过程均密切相关。叶玉兰等[14]研究表明，塞来昔布、培美曲塞可能通过抑制PI3K/AKT信号通路中AKT蛋白活性，抑制肺腺癌细胞增殖并诱导其凋亡。陈晨等[15]研究表明，PI3K/Akt通路与异丙醇诱导下的非小细胞癌细胞的迁移、侵袭过程有关。郭忠英等[16]研究表明，前列腺癌新生血管生成与PI3K/AKT信号通路相关蛋白关系密切。Xu等[17]研究表明，PI3K通过AKT调控细胞周期蛋白D表达，从而影响细胞增殖。Kumar等[18]研究表明，抑制PI3K/AKT介导的AP-1活化可抑制肿瘤生成和血管生成过程。本研究进一步研究TWP对A549细胞PI3K/AKT信号通路的影响，结果显示，A549细胞中磷酸化PI3K、AKT蛋白表达水平均随TWP浓度升高而显著降低，表明TWP可抑制A549细胞中PI3K、AKT蛋白磷酸化，并推测TWP抑制A549细胞增殖、迁移、促血管生成并诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制，可能与抑制PI3K/AKT通路激活有关。

综上所述，TWP可抑制A549细胞的增殖、迁移、诱导血管生成行为，并诱导细胞凋亡，这一作用机制可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路激活实现的。但具体作用机制还需进一步设计PI3K/AKT信号通路抑制组进行验证。