CHD1L对胃癌细胞增殖、侵袭及转移的影响

李迪诺，李谌

(1.锦州医科大学附属第一医院胃外科；2.锦州医科大学附属第一医院分子检测中心，辽宁 锦州 121000)

胃癌是全球第二大常见的恶性肿瘤[1]。原癌基因的激活、抑癌基因的缺失等在胃癌的发生发展中扮演重要角色[2]。

CHD1L(chromodomain helicase/adenosine triphosphatase DNA binding protein 1-Like，CHD1L)位于人类1号染色体的长臂的1q21区，由53152个碱基对组成，包含23个外显子、一个编码长度为897个氨基酸的蛋白质开放阅读结构和一个保守区域[3-4]。

CHD1L过表达会导致染色质过度松弛，使DNA碱基发生错配现象，导致癌症的演变[5-6]，过度表达CHD1L显著促进结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移，沉默CHD1L基因可降低前列腺癌细胞的侵袭迁移能力[7]，下调CHD1L mRNA表达水平肝癌细胞增殖能力、迁移和侵袭能力明显下降[8]；靶向CHD1L通过PI3K/Akt/MMP信号通路可以抑制乳腺癌细胞的侵袭[9]；但能否促进胃癌细胞的增殖、凋亡、侵袭转移未有相关研究，本文通过研究胃癌生物学行为过程中CHD1L信号通路调控机制，探究其潜在价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胃粘膜上皮细胞株GES-1和胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45、MGC-823、MGC-803来源于国家中心细胞库，胃癌MGC-823细胞株中的CHD1L表达含量较高，可以用于后续试验。

慢病毒pLVshRNA-Puro构建由美国Clon-tech公司完成、Western Blot测定相关试剂与耗材、细胞增殖活性、凋亡检测相关试剂与耗材购自美国Invitrogen公司、细胞侵袭试验所需试剂与耗材由Millipore公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 慢病毒shRNA序列构建

GENEBANK数据库对CHD1L mRNA全序列进行搜索，利用在线设计软件(http：//www.exiqon.com/)，设计特异性shRNA序列(CHD1L-shRNA-1、CHD1L-shRNA-2、CHD1L-shRNA-3)。将pLVshRNA-Puro片段(NotⅠ和EcoRⅠ双酶切处理)与5’端磷酸化，互补片段退火处理后的合成片段连接，命名为pLVshRNA-Puro-CHD1L，阴性对照组命名为pLVshRNA-Puro-NC，利用大肠杆菌K-12的衍生菌DH5α制备阳性克隆质粒，经测序鉴定后将阴性对照质粒和干扰质粒进行包装后保存于-80 ℃冰箱内。

1.2.2 慢病毒感染MGC-823细胞

将MGC-823细胞接种于6孔板中(2×105个/孔)，分别取3组0.5 mL浓缩病毒和阴性对照感染MGC-823细胞48 h后，将嘌呤霉素加到继续培养24 h后的细胞中，使其最终浓度为0.25 μg/mL，48 h后会形成细胞克隆，扩大培养单克隆细胞集落。

1.2.3 沉默CHD1L干扰序列的筛选

MGC-823细胞被慢病毒感染后提取其总蛋白，Western Blot计算CHD1L蛋白和β-actin蛋白积分光密度(integrated optical density，IOD)，筛选出沉默率最大的干扰组序列。

1.2.4 Western Blot测定胃癌细胞相关蛋白的表达

利用沉默率最大的慢病毒感染MGC-823细胞后，Western Blot测定与胃癌细胞p53、p21、Nur77、ARHGEF9的表达。

1.2.5 CHD1L沉默对胃癌细胞增殖与凋亡的影响

1.2.5.1 MTT测定CHD1L沉默对胃癌细胞增殖的影响

96孔细胞培养板中接种200 μL稀释好的MGC-823细胞(1×103个/孔)，利用MTT细胞活力测定法，对细胞生长增殖抑制率进行测定与统计学分析。

抑制率(%)=(1-干扰组OD/对照组OD)×100%

1.2.5.2 流式细胞测定CHD1L沉默对胃癌细胞凋亡的影响

MGC-823被慢病毒感染48 h后，经胰酶消化、PBS重悬漂洗、离心，继续常规培养，24 h后胰酶消化成单细胞悬液，利用Attune NxT流式细胞仪测定CHD1L沉默对胃癌细胞凋亡的影响。

1.2.6 CHD1L沉默对胃癌上皮细胞-间充质转化的影响

将MGC-823细胞各分为两部分(5×105个/毫升)。Transwell小室侵袭在培养48 h后对迁移的细胞数、细胞划痕愈合测定方法对细胞间距离的均值进行测定和统计学分析，探讨其对胃癌上皮细胞-间充质转化的影响。

抑制率=(对照组-干扰组)/对照组×100%

1.2.7 统计学方法

2 结 果

2.1 慢病毒感染胃癌细胞介导CHD1L基因沉默细胞株的建立

慢病毒感染MGC-823细胞48 h后，荧光蛋白表达率约为50%，随着传代次数的增加(3代、15代、25代)，荧光蛋白表达率能稳定的保持在95%左右，说明慢病毒可稳定与靶细胞的基因组进行整合，见图1。

A：CHD1L-shRNA-1组；B：CHD1L-shRNA-2组；C：CHD1L-shRNA-3组；D：阴性对照组

2.2 胃癌细胞CHD1L蛋白的表达情况

与阴性对照组相比，CHD1L-shRNA-1、CHD1L-shRNA-2、CHD1L-shRNA-3干扰下胃癌细胞CHD1L蛋白表达量均下降，具有统计学意义(P=0.013、P=0.035、P=0.027)，CHD1L-shRNA-1基因沉默效果最好，可进行后续的实验，见图2～3。

A：NC对照组β-actin与CHD1L蛋白表达；B：CHD1L-shRNA-3组β-actin与CHD1L蛋白表达；C：CHD1L-shRNA-2组β-actin与CHD1L蛋白表达；D：CHD1L-shRNA-1组β-actin与CHD1L蛋白表达

图3 Western Blot免疫印迹检测CHDIL蛋白表达

2.3 CHD1L沉默对胃癌细胞相关蛋白表达的影响

CHD1L-shRNA-1干扰下的胃癌细胞p53蛋白质表达量比对照上调31.24%，具有统计学意义(P=0.041)；Nur77蛋白质表达量比对照上调52.36%，具有统计学意义(P=0.026)；p21表达水平提高了48.37%(P=0.030)；ARHGEF9蛋白质表达量比对照上调49.78%，具有统计学意义(P=0.019)，CHD1L沉默对与肿瘤发生发展有抑制作用的效应分子产生促进作用，见图4。

A：阴性对照组不同蛋白表达情况；B：空白对照组不同蛋白表达情况；C：CHD1L-shRNA-1组不同蛋白表达情况

2.4 MTT测定CHD1L沉默对胃癌细胞增殖的影响

与对照组相比，MGC-823细胞的增殖过程被抑制，作用时间的不断延长，MGC-823细胞的抑制率也不断增加，具有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图5 CHD1L沉默时间对胃癌细胞细胞活力变化的影响

2.5 流式细胞术测定CHD1L沉默对胃癌细胞凋亡与周期分布的影响

CHD1L-shRNA-1与对照组细胞相比凋亡趋势明显(P=0.025)，说明CHD1L沉默可以诱导MGC-823细胞凋亡；与对照组相比，MGC-823细胞中CHD1L被沉默后S、G1期细胞数量分别呈现明显的减少、增多趋势，细胞周期明显被阻滞在G1期，具有统计学意义(P=0.028、P=0.016)，见图6～9。

A：CHD1L-shRNA-1实验组胃癌细胞凋亡情况；B：阴性对照组胃癌细胞的凋亡情况；C：空白对照组胃癌细胞的凋亡情况

图7 CHD1L沉默后胃癌细胞凋亡率

A：CHD1L-shRNA-1实验组胃癌细胞分布周期；B：阴性对照组胃癌细胞分布周期；C：空白对照组胃癌细胞分布周期

图9 CHD1L沉默后胃癌细胞周期分布

2.6 CHD1L沉默对胃癌上皮细胞-间充质转化的影响

2.6.1 CHD1L沉默对胃癌细胞侵袭的影响

CHD1L沉默48 h后，实验组比阴性对照组穿膜细胞数量明显减少(P=0.042)，抑制率为59.55%，说明沉默CHD1L能显著抑制MGC-823细胞的侵袭力，见图10 和表1。

A：CHD1L-shRNA-1实验组胃癌细胞侵袭情况；B：阴性对照组胃癌细胞侵袭情况；C：空白对照组胃癌细胞侵袭情况

表1 CHD1L沉默后穿膜胃癌MGC-823细胞数量比对

2.6.2 CHD1L沉默对胃癌细胞迁移的影响

CHD1L沉默24 h后，阴性对照组和空白对照组细胞划痕已基本长满，而实验组细胞之间还存在一定距离的间隙；与空白对照组和阴性对照组相比，实验组MGC-823细胞迁移距离缩短为(0.54±0.34)μm，具有统计学意义(P=0.029)，说明CHD1L沉默后MGC-823细胞水平运动距离明显降低，有效抑制胃癌细胞的迁移，见图11。

A：CHD1L-shRNA-1实验组胃癌细胞迁移情况；B：阴性对照组胃癌细胞迁移情况；C：空白对照组胃癌细胞迁移情况

表2 CHD1L沉默后后胃癌MGC-823细胞迁移距离

3 讨 论

CHD1L属于SNF-2类家族成员中发挥致癌作用的唯一基因[10]。鼻咽癌和乳腺癌患者中，CHD1L过表达可能会成为重要的预后标志物[11]；在肺腺癌患者中，肿瘤转移与过表达CHD1L密切相关[12]。在肝癌患者中，发现CHD1L的扩增和过表达[13]。沉默CHD1L后MGC-823细胞增殖过程被抑制，推测沉默CHD1L后，一些抑癌基因表达水平显著提高实现对肿瘤细胞DNA合成的抑制，说明CHD1L可能为临床基因治疗提供新的靶点。

在细胞外的调节细胞生长、分化、凋亡等信号刺激下，诱导孤儿受体超家族Nur77与CHD1L结合后，能使其具有抗细胞凋亡的能力[14-16]，本实验发现CHD1L沉默可以诱导胃癌MGC-823细胞凋亡，推测CHD1L沉默后其转录水平发生变化，阻碍了Nur77从细胞核到线粒体的移动[17]。

生长肿瘤细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤的侵袭和转移过程发挥至关重要的作用[18]。本实验发现：在迁移距离和穿膜细胞数量方面实验组明显减少，具有统计学意义(P<0.05)；ARHGEF9在信号通路和肌动蛋白细胞骨架调节方面起关键作用[19]，ARHGEF9是通过免疫共沉淀CHD1L相关的基因克隆所得，推测CHD1L沉默可以上调ARHGEF9和Cdc42-GTP表达水平，抑制了再生化的肌动蛋白形成伪足样结构的步骤，对胃癌细胞的远处转移和侵袭过程进行抑制。