长链非编码RNA BANCR在三阴性乳腺癌中的表达及临床意义

刘星，蔺广荣

(1.锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000；2.滨州市人民医院，山东 滨州 256610)

乳腺癌已经成为全人类最常见的癌症类型，根据国际癌症研究机构统计的2020年全球癌症情况分析，对女性来说，乳腺癌是所有癌症中发生频率最高和致死的首要癌症类型，每年呈递增趋势，严重威胁人类的身心健康[1]。乳腺癌作为一种异质性高的疾病，根据雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2 extracellular domain，Her-2)和Ki-67表达情况分为不同的分子亚型，包括Luminal A、Luminal B、Her-2扩增型和三阴型。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)占总体乳腺癌发病率10%～20%，侵袭性强，预后差，由于缺乏有效治疗靶点，化疗是主要的治疗手段，近年来免疫治疗、PARP抑制剂等的应用一定程度上改善了部分三阴性乳腺癌的预后，但相较于其他亚型预后仍差，三阴型亟待寻求有效靶点、开发新的有效的治疗手段。随着 RNA测序技术和生物信息学的不断发展和应用，非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)逐渐进入了人们的视野，它们不具备编码蛋白质的能力，但参与了多种生物学进程。越来越多的ncRNA在乳腺肿瘤发生的不同阶段表现出巨大的潜力，影响细胞的死亡、代谢、上皮-间质转化、转移和耐药性。在已知的ncRNA的研究中，长链非编码 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和微小 RNA(micro RNA，miRNA)被报道的比较多，lncRNA转录本长度超过200个核苷酸，在肿瘤中的作用不容小觑，包括在表观遗传调控、DNA损伤和细胞周期调控、参与信号转导和介导激素导致的癌症等。其中lncRNA BANCR是由BRAF基因发生突变后产生的，693-bp lncRNA，最早是Flockhart等人在黑色素瘤细胞中发现其可促进黑色素瘤细胞转移。继而发现BANCR在甲状腺癌、视网膜母细胞瘤、肺癌、胃癌等多种肿瘤中均有异常表达，且与预后有一定相关性，然而其在乳腺癌中的表达及临床意义鲜见报道。本研究拟利用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测TNBC癌灶及癌旁组织中BANCR表达水平差异，探讨BNACR在TNBC中的表达意义及与患者术后的关系，为TNBC的治疗及预后提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2011年1月至2015年12月于锦州医科大学附属第一医院行乳腺癌手术切除并经病理诊断为TNBC的患者总计110例，均为女性，临床病史资料完整，术前均未经化疗、内分泌治疗及其它任何抗肿瘤治疗。年龄31～72岁，平均年龄(50.5±10.1)岁，<50岁42 例，≥50岁68 例；肿瘤直径<5 cm 78 例，≥5 cm 32例，淋巴结转移59例，无转移 51例；未绝经 62例，已绝经48例；临床分期Ⅰ+Ⅱ期67例，Ⅲ期43例。手术取材的新鲜冰冻组织标本，置液氮冷却后送-80 ℃冷冻冰箱保存。本研究经过锦州医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准。所有标本检测均经患者及其家属同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂及设备

Trizol购自美国Invitrogen公司，LncRNA-BANCR及内参GAPDH引物购于北京鼎国生物公司，RT-PCR试剂盒购自美国Santa公司，PCR仪购自美国ABI公司。

1.3 实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

选取患者的肿瘤组织作为研究对象，同时选取相应的瘤旁组织(3 cm以外)作为对照。将组织剪碎后，用Trizol试剂提取组织总RNA，按照试剂盒说明书操作将总RNA逆转录成cDNA。实时荧光定量PCR反应体系按照SYBR Green说明书配制。内参基因设置为GAPDH。实时荧光定量PCR扩增条件为：95 ℃预变性3 min，随后 95 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，共40个循环。每例设2个复孔，取其平均值。引物及探针序列如下：BANCR上游引物正向：5’-ACAGGACTCCATGGCAAACG-3’,下游引物反向：5’-ATGAAGAAAGCCTGGTGCAGT-3’。GAPDH上游引物正向：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’GAPDH下游引物反向：5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAA-3’，BANCR相对于GAPDH的表达使用2-△△Ct法计算和标准化。

1.4 随访

术后对患者10个月1次的定期随访，主要以门诊复查或电话随访形式进行。总生存(OS)时间定义为患者自确诊肿瘤至死亡或者随访截止的时间。随访截止时间为2019年3月31日，生存期以月为计数单位。随访的主要内容包括患者一般临床资料，有无复发及生存状态。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 TNBC肿瘤组织及癌旁组织中BANCR的表达

RT-PCR结果显示，BANCR在TNBC中的表达水平为(2.512±0.857)，在癌旁组织中的表达水平为(1.201±0.721)，在癌组织中的表达水平约是癌旁组织表达水平2倍，差异有统计学意义(t=8.666，P<0.01)，见图1。

图1 BANCR在癌旁组织及癌组织中表达水平

2.2 影响TNBC患者BANCR表达的临床因素

以BANCR表达的中位值为临界值分成两组：BANCR高表达组(n=55)和BANCR低表达组(n=55)，TNBC患者BANCR的表达与临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05)，与患者年龄、肿瘤直径及绝经状况无关(P>0.05)，见表1。

表1 三阴性乳腺癌患者BANCR表达的临床影响因素的分析[n(%)]

2.3 BANCR的表达与TNBC患者预后之间的关系

110例患者均无失访，通过用Kaplan-Meier绘制生存分析曲线，BANCR高表达组中位生存时间为36个月，低表达组为53个月，经Log-rank检验分析比较二者具有差异统计学意义(P=0.021)，见图2。

图2 BANCR高表达组和低表达组患者术后总生存曲线比较

2.4 BANCR的表达水平与临床病理参数的单因素及多因素分析

为了探讨临床病理参数影响预后的危险因素，首先将之前统计的各患者临床病理参数与生存率进行单因素分析，然后将单因素分析结果中有统计学意义的指标进行多因素Cox分析，结果显示，有淋巴结转移、TNM分期及BANCR高表达是影响患者术后的独立危险因素，见表2。

表2 三阴性乳腺癌患者不同临床病理参数与生存率的单变量和多变量分析

3 讨 论

乳腺癌治疗目前已经进入分子分型时代，部分亚型已经找到有效治疗靶点，三阴性乳腺癌被认为是一种难治性乳腺癌，常常见于绝经前甚至是更年轻的女性，容易较早出现淋巴结转移和内脏转移，是高侵袭、早复发的一种乳腺癌分子亚型，因缺乏激素受体的表达和表皮生长因子受体2(Her-2)的表达，长久以来，化疗一直是其主要的治疗手段。近年来，免疫治疗在三阴型乳腺癌的研究如火如荼，Impassion130研究对于PD-L1阳性的患者应用阿替利珠单抗联合白蛋白紫杉醇中位OS达25个月，也是目前为止在晚期转移性三阴性乳腺癌总生存最长的研究。但是相较于其他乳腺癌的分子亚型，这个数据显然并不让大家满意。随着分子生物学技术的发展，通过对通路、基因组学、蛋白组学及代谢组学等研究了解其生物信息，揭示其分子本质，发现更具针对性的、更有效的且毒性更低的诊治手段，才能达到真正意义上的精准诊治和个体化治疗。

近年来，lncRNA成为分子生物学研究的热点之一，目前已发现多个重要的lncRNA(SNHG12、DANCR、ANRIL)[2-4]参与TNBC的发生与发展，但绝大多数lncRNA在TNBC诊断和治疗中的作用机制尚需深入的探索。BANCR定位于9号染色体上q21.11位点，全长693 bp，最初是通过RNA-seq对致癌基因 BRAF 600E表达影响的转录物进行筛选而首次被发现[5]。目前已证实在多种实体肿瘤中异常表达。体外细胞试验中发现，敲除BANCR后显著抑制了乳腺癌细胞(MCF-7)的增殖、侵袭和转移能力[6]。He等学者[7]采用RT-PCR、流式细胞仪检测BANCR在膀胱癌组织中表达显著下调，其过表达能显著抑制细胞增殖、侵袭。由此可见，BANCR具有组织特异性。本研究采用RT-PCR技术检测了BANCR在110例TNBC及癌旁组织中的表达情况，发现BANCR在TNBC中表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。推测BANCR参与了TNBC的发生。研究表明BANCR在食管癌中表达与肿瘤分化、分期及淋巴结转移有关[8]。在结肠癌中，其表达与淋巴结转移相关，且是患者预后不良独立危险因素[9]。本研究通过分析BANCR在TNBC中表达与临床病理参数的关系，发现BANCR与TNM分期及淋巴转移相关(P<0.05)，与其它病理参数无关。推测BANCR参与了TNBC的发展。本研究通过用Kaplan-Meier绘制生存分析曲线，BANCR高表达组的中位总生存时间为36个月，低表达组则为53个月，经Log-rank检验分析比较二者具有差异统计学意义(P=0.021)。BANCR高表达组患者生存率低，复发率高，预后差，因此，BANCR在三阴性乳腺癌具有临床预后判断价值。我们进一步通过单因素及多因素COX分析发现，TNM分期、淋巴结转移及BANCR高表达是影响患者术后的独立危险因素(P<0.05)。本研究是首次发现BANCR在三阴性乳腺癌中异常表达并探讨其临床意义。

三阴性乳腺癌基于基因表达谱、蛋白组学等进一步又分为不同的亚型，包括雄激素受体型(LAR)、基底样型(BLIS)、免疫调节型(IM)和间质型(MES)[10]。随着转录组技术和微阵列技术的进步，我们发现大量的lncRNA与乳腺癌各种亚型之间存在着密切的关系[11]。三阴性乳腺癌不同亚型的lncRNA表达亦存在差异：NR 003221，TCONS 00000027 在间质型(MES)和基底样型(BLIS)表达高，ENST00000443397主要在免疫调节型(IM)中表达，而ENST00000447908 在雄激素受体型(LAR)中表达增高[12]。在1 0428例乳腺癌患者NGS检测发现整体人群Braf突变频率为1.3%，而三阴性亚型突变频率高达55%。BANCR作为BRAF激活突变后的产物，或是三阴性乳腺癌相较于非三阴型乳腺癌来说相对特异的lncRNA。

综上所述，BANCR与三阴性乳腺癌的发生发展有关，是三阴性乳腺癌的独立预后指标，有望成为潜在治疗靶点。本研究为后期细胞学和动物模型实验提供了实验依据，同时我们也会依托于转录组技术及微阵列技术进一步探讨在三阴性乳腺癌的不同亚型中BANCR的表达情况，BANCR在三阴性乳腺癌中的促肿瘤具体机制尚待进一步研究证实。