针刀干预对膝骨关节炎兔股直肌纤维化的影响

刘 晶，曾维铨，林巧璇，卢莉铭，郭泽兴，刘 洪，张良志，修忠标，4

1 福建中医药大学附属人民医院，福建福州 350004；2 福建中医药大学附属康复医院，福建福州 350003；3 福建中医药大学，福建福州 350122；4 中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建福州350122

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）引起的疼痛及功能障碍严重影响着中老年患者的生活质量。针刀疗法作为中医原创技术，能有效调节骨骼肌功能，改善KOA 疼痛和功能障碍［1］。笔者所在团队前期临床研究也显示，基于经筋理论针刀循膝周经筋病灶点松解能调整KOA 关节间隙，有效缓解疼痛和改善功能［2］，然而其作用机制尚不明确。骨骼肌慢性损伤后的愈合过程主要有炎症、再生和纤维化3 个阶段，结局是Ⅰ型胶原纤维（type Ⅰcollagen fibers，ColⅠ）、波形蛋白（vimentin，VIM）、α-肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin，α-SMA）等细胞外基质的沉积，影响骨骼肌功能［3-4］。针刀治疗KOA 的作用机制可能与调节骨骼肌慢性损伤纤维化有关，但目前还无相关报道。因此，本研究从股直肌纤维化的角度探讨针刀治疗KOA可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性6 月龄新西兰大白兔24 只，体质量（2.0±0.5）kg，订购于上海松联实验动物责任有限公司［生产许可证号码：SCXK（沪）2017-0008］，委托福建省中医药研究院实验动物中心［SYXK（闽）2016-0005］代购并饲养。实验动物单笼喂养，饲养房温度20～25 ℃，湿度30%～60%，自然光照，自由进食、饮水。适应性饲养1周后，按照体质量进行编号，并应用随机数字表法将其分为空白组、模型组和针刀组，每组8只。本实验已通过福建省中医药研究院动物实验伦理委员会批准（FJATCM-IAEC2019037），整个实验过程中对动物的各种处理均遵照中华人民共和国科技部2006 年颁布的有关动物的使用及伦理学规定。

1.2 主要试剂和仪器

Masson染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），ColⅠ、VIM、α-SMA、β-actin、GAPDH 抗体（北京博奥森生物技术有限公司），二抗（武汉三鹰生物技术有限公司），Trizol（美国Thermo公司），mRNA逆转录试剂盒（中国北京康为世纪），引物（上海生工生物工程股份有限公司），10%水合氯醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），4%多聚甲醛、10% EDTA、0.9%NaCl 注射液（南京丁贝生物有限公司）。一次性使用0.4 mm×40 mm 无菌小针刀（江西老宗医医疗器械有限公司），DR 机（日本岛津），3.0 T 高场强核磁共振（德国西门子），光学显微镜、自动脱水机、组织包埋机、Leica 2025 石蜡切片（德国Leica 公司），高分子石膏（陕西安信医学技术开发有限公司），普通石膏（浦江健宇卫生材料有限公司），手术刀片及相关器械（上海医疗器械批发部有限公司），一次性包埋盒、包埋模具（上海源叶生物技术有限公司），黏附载玻片、盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司）。

1.3 KOA兔模型制备及评价

采用改良Videman 法［5］将兔子仰卧于固定架上，膝前放置石膏托，高分子石膏绷带单层螺旋缠绕，保持膝关节伸直中立位0°，踝关节背曲60°，最后使用防啃咬绷带环形缠绕高分子石膏表面。造模6周后Lequesne MG 膝关节级别评分增高，经X线和MRI 影像学检测提示关节间隙变窄、软骨面欠光滑，股直肌张力增高，髌上1～3 cm 股直肌周围可触及条索或硬节为模型成功。

1.4 干预方法

造模成功1 周后，针刀组依据《中国经筋学》［6］膝关节经筋病灶点命名及定位，根据兔的骨度分寸，选取治疗点“鹤顶次”（足阳明经筋病灶点，股四头肌肌腱髌骨正上缘附着处）、“髌外上”（足阳明经筋病灶点，股外侧肌肌腱髌骨外上缘附着处）、“髌内上”（足阳明经筋病灶点，股内侧肌肌腱髌骨内上缘附着处），在施术部位，用活力碘消毒3遍，然后铺无菌洞巾，使治疗点正对洞巾中间，术者戴好无菌手套，采用一次性使用0.4 mm×40 mm 无菌小针刀进行松解，刀口线垂直皮肤进针刀，针刀抵达病变处行提插刀法松解，范围不超过0.5 cm，操作结束后用无菌干棉球在手术部位按压1 min，见图1。每7 d干预1 次，干预4 次。空白组和模型组只做同样的抓取和固定，不予针刀治疗。

图1 针刀治疗过程Figure 1 Operating processes of acupotomy

1.5 指标检测及方法

1.5.1 Masson 染色 于针刀干预结束后1 周，麻醉下耳缘静脉空气栓塞处死，迅速解剖左侧膝关节，行髌前正中切口，逐层分离至关节囊，用尖刀切断股四头肌在髌骨上缘附着处肌腱，分离股直肌，迅速取髌上1～3 cm 股直肌，用生理盐水清洗、滤纸吸干后，投入4%多聚甲醛中固定24 h，固定后用流水冲洗标本4 h，脱水、包埋，以厚度5 μm 制备组织切片。将组织切片置于60 ℃烘箱中干燥30 min后，常规脱蜡至水；随后用配置好的Weigert铁苏木素染色5 min；酸性乙醇分化液分化5 s，水洗，蓝化液反蓝5 min，蒸馏水冲洗，丽春红酸性复红液复红5～10 min，弱酸工作液洗1 min，磷钼酸溶液洗1～2 min，弱酸工作液水洗1 min，苯胺蓝染色1～2 min，弱酸工作液水洗1 min。95%酒精、无水酒精、二甲苯透明，中性树胶封固。显微镜下观察并拍照，用Image J图像分析软件分析计算胶原容积分数。

1.5.2 RT-PCR 针刀干预结束1周后，取兔股直肌组织，在研钵中加入液氮快速研磨，装入预冷的EP管，加入1 mL Trizol，吹打，室温静置5 min；提取总RNA，核酸紫外分光光度计测定RNA 纯度和浓度；取总RNA 3 μL进行反转录。采用MMLV-PCR 扩增试剂盒反转录二步法，cDNA 置于-20 ℃保存备用。PCR 反应体系中含标本体系3 μL，引物体系17 μL，总体系20 μL。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计，引物序列：GAPDH，正向：TGGAATCC ACTGGCGTCTTCAC，反向：AGGATGCGTTGCTGAC AATCTTGA；ColⅠ，正向：AGGAACCAAGGGACCTA AG，反向：CCAGGGAAACCAGTCATAC；VIM，正向：TGGACATTGAGATCGCCACC，反向：GAGTGGGTG TCAACCAGAGG；α-SMA，正向：GTCAGGAATCCC GTGAAGCA，反向：CATTGTCACACACAAGGGCG。PCR 反应条件：95 ℃10 min，95 ℃15 s，72 ℃30 s，共40个循环。用相对定量2-ΔΔCt法分析结果。

1.5.3 Western blot 组织裂解法提取兔股直肌组织总蛋白，BCA法测定蛋白含量后，SDS-PAGE 凝胶电泳，NC 膜转印，一抗、二抗孵育，ECL 显色曝光。Gel Doc 2000 凝胶成像系统成像，Quantity One 软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin 或GAPDH 作为内参照蛋白进行校准，采用目标蛋白条带灰度值/βactin 或GAPDH 条带灰度值来表示目的蛋白相对表达水平。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 3组兔股直肌Masson染色形态学比较

空白组可见整齐的被红染的骨骼肌纤维；模型组可见骨骼肌纤维破坏，被大量蓝染的胶原纤维包绕；针刀组可见骨骼肌纤维较为整齐，被少量蓝染的胶原纤维包绕。与空白组比较，模型组股直肌胶原容积分数增加（P＜0.01）；与模型组比较，针刀组股直肌胶原容积分数减小（P＜0.01）。见图2。

图2 3组兔股直肌Masson染色形态学比较Figure 2 Comparison of Masson stain in rectus femoris tissue of three groups

2.2 3 组兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA mRNA 表达比较

见表1。

表1 3组兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA mRNA表达比较（）Table 1 Comparison of ColⅠ，VIM and α-SMA mRNA expression in rectus femoris tissue of three groups（）

表1 3组兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA mRNA表达比较（）Table 1 Comparison of ColⅠ，VIM and α-SMA mRNA expression in rectus femoris tissue of three groups（）

注：与空白组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01。Notes:Compared with the blank group,1)P＜0.01.Compared with the model group,2)P＜0.01.

2.3 3 组兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA 蛋白表达比较

见图3和表2。

表2 3组兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA蛋白表达的比较（）Table 2 Comparison of ColⅠ，VIM and α-SMA protein expression in rectus femoris tissue of three groups（）

表2 3组兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA蛋白表达的比较（）Table 2 Comparison of ColⅠ，VIM and α-SMA protein expression in rectus femoris tissue of three groups（）

注：与空白组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01。Notes:Compared with the blank group,1)P＜0.01.Compared with the model group,2)P＜0.01.

图3 3组兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA蛋白条带显影Figure 3 Protein band development of ColⅠ,VIM and α-SMA in rectus femoris tissue of three groups

3 讨论

近年来普遍认为骨骼肌慢性损伤引起的筋骨失衡是导致KOA 疼痛和功能障碍的重要机制［7-8］。研究表明异常姿势、外伤等均可引起膝关节骨骼肌慢性损伤［9-10］。骨骼肌纤维化在慢性骨骼肌损伤中扮演重要角色，当骨骼肌损伤出现后，机体在自我修复过程中，肌卫星细胞会过早分化成熟，促进生肌祖细胞向纤维祖细胞转化，导致ColⅠ、VIM、α-SMA 等细胞外基质沉淀，出现骨骼肌纤维化，影响骨骼肌功能［11］，该过程受到Wnt 通路、TGF-β 通路、CTGF通路等一系列复杂的调控［12］。

研究表明推拿、针刺等方法干预能够促进骨骼肌纤维化的修复，但目前临床缺乏治疗KOA 慢性骨骼肌纤维化的有效手段［13-14］。

调节骨骼肌功能和恢复筋骨平衡是改善KOA疼痛及功能障碍的有效途径［15-16］。中医经筋理论深刻揭示了肌肉骨骼系统之间内在联系，从力学角度阐释KOA“横络痹阻、筋骨失衡”的核心病机。针对经筋病机及病候特点，总结了“以痛为腧”和“横络解结”的治疗方法。针刀最主要的功效在于松解软组织粘连、瘢痕，切割挛缩，疏通堵塞，调节力学平衡［17-18］。因此，基于经筋理论针刀对KOA 筋骨失衡模式下足三阳、足三阴经筋在膝部常见筋结点的松解，从而恢复筋骨平衡，达到“筋柔骨正，调筋治骨”的目的［19］，治疗KOA 取得确切疗效［20-21］。股四头肌是伸膝装置重要组成部分，KOA 发病与股四头肌功能下降等密切相关，通过松解股四头肌病灶点和加强肌力训练，可有效缓解KOA 患者膝关节疼痛和功能障碍［22-23］。股直肌连接了髋关节和膝关节，当髋膝联动功能失常、下肢力线失衡，股直肌将会更容易受累而发病［24］。因此，本研究探讨基于经筋理论针刀松解股四头肌经筋病灶点对股直肌病变的影响，以揭示针刀治疗KOA可能的作用机制。

本项实验通过复制KOA 兔模型发现股直肌纤维化明显，基于经筋理论针刀松解股四头肌经筋病灶点能下调KOA 股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA mRNA和蛋白的表达，减轻股直肌纤维化程度。针刀促进KOA 股直肌纤维化修复较推拿、针刺等具有明显的优势：针刀具有“刀割”和“针刺”的双重作用，一方面，针刀通过松解骨骼肌粘连、瘢痕、挛缩，疏通堵塞，改善局部血液循环和力学环境，有利于骨骼肌纤维的再生和胶原纤维的降解［25］；另一方面，针刀较强的刺激作用可能激活人体修复系统，能促进骨骼肌的修复，从而修复KOA 骨骼肌的功能，调节筋骨平衡［26］。