电针百会、神庭对系统炎症诱导认知功能障碍的海马抗炎作用

陈小梅，庞莉娜，王志福

1 福建中医药大学康复医学院，福建福州 350122；2 福建中医药大学中西医结合学院，福建福州350122

脓毒症相关脑病（sepsis-associated encephalopathy，SAE）是当机体出现严重的全身性感染时，发生弥漫性脑功能障碍，可出现谵妄、意识不清，甚至是昏迷，是临床脓毒症后的一种严重的神经后遗症，SAE 增加了脓毒症患者的死亡率，高达70%［1］；其可能的机制包括血管损伤和神经炎症，其中神经炎症是关键的驱动因素，大量的小胶质细胞激活在这一过程扮演核心角色［2-3］。小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，监测脑内微环境并对其变化迅速做出反应［4］。脂多糖（LPS）是革兰阴性菌外膜的关键成分，可引起血浆和海马炎症因子增多，小胶质细胞激活发生神经炎症反应，已广泛应用于脓毒症的相关研究［5-6］。已有研究证实细胞因子，特别是肿瘤坏死因子（TNF-α）在LPS注射后1～3 h内迅速产生，并通过受损的血脑屏障传递信号，脑内的TNF-α 增加可激活海马小胶质细胞调节神经元功能，引起海马形态和功能发生改变，出现急性认知功能损伤［3，7-11］。

早期治疗脓毒症病人是预防脑损伤及随后出现的认知功能障碍的关键。已有研究证明，电针具有明显的全身抗炎作用［12-14］，电针百会、神庭减轻神经炎症及改善认知功能效果明确［15-17］。因此本研究拟探讨电针百会、神庭是否通过下调系统炎症、改善海马区神经炎症，从而减轻内毒素性脑损伤，改善认知功能障碍。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康清洁级成年C57BL/6 雄性小鼠45 只，体质量18～22 g，由福建中医药大学实验动物中心提供，经福建中医药大学伦理委员会批准。于自然昼夜交替和22～25 ℃室温下饲养，自由进食水。适应性饲养1周后，采用随机数字表法分为对照组、内毒素性脑损伤组（简称模型组）和内毒素性脑损伤＋电针组（简称电针组），每组各15只。

1.2 主要试剂与仪器

异氟烷（深圳瑞沃德公司），戊巴比妥钠（深圳瑞沃德公司），0.5 寸毫针（华佗牌30 号），HANS-200E 穴位神经刺激仪（南京济生医疗科技有限公司），脂多糖内毒素（货号：L2630，Sigma公司，美国），4%多聚甲醛，Iba-1 一抗（货号：ab5076，Abcam），生物素标记物二抗（货号：ab150129，Abcam），TNF-α ELISA 试剂盒（货号：MM-0132M2，福州沃森生物有限公司），Iba-1 ELISA 试剂盒（货号：MM-44902M2，福州沃森生物有限公司），新物体识别实验装置及动态图像采集分析系统（XR-XX117，福建中医药大学康复产业研究院），冰冻切片机（Thermo Scientific HM525 NX，福建中医药大学康复产业研究院）。

1.3 动物模型制备

模型组和电针组腹腔注射LPS（货号：L2630，Sigma 公司，美国）1 mg/kg，建立内毒素性脑损伤；对照组给予同容量的溶剂。

1.4 干预方法

电针组进行电针刺激，电针的穴位选取百会（顶骨正中，两耳连线中点）、神庭（前正中线上，在额顶骨缝交界线前方处）（参考《实验针灸学》中的定位方法）；将无菌针灸针（直径0.3 mm，长13 mm，华佗牌针灸针）平刺入穴位1 mm，通过连接HANS-200E 穴位神经刺激仪（南京济生医疗科技有限公司），给予10 Hz 连续波，刺激强度为0.5 mA，于造模前15 min及行为学测试前各电针1次。对照组在同等条件下抓取后回笼饲养，不予任何治疗。模型组不干预。

1.5 www（what-where-when）行为学测试

根据行为学参考文献［18］，分为适应期和测试期，将小鼠置于1 个60 cm×60 cm×40 cm 的屏敝箱中，适应后进行正式测试期，任务分为3 个5 min 阶段，每个阶段试验间隔时间为50～55 min。第1 个阶段为4个相同的A以三角形呈现的物体；第2个阶段为4个相同的B排列成1个正方形；最后测试阶段使用新的物体排列方式，将“B”物体（Recent B）仍然在角落处；1 个“A”物体（称为Stationary A）停留在1个角落，而第2个A 物体（称为Displaced A）则被放置在另一个角落。视频由安装在测试区域上方的摄像机录制，采用三点动态跟踪法记录与每个物体接触的时间。测试阶段的位置偏好被计算为“what”“where”“when”，计算公式为：

1.6 免疫组织化学染色

行为学试验结束后，立即腹腔注射麻醉，先用30 mL 的生理盐水灌注，再用30 mL 4%的多聚甲醛灌注后取脑；取出后将脑浸泡在4%的多聚甲醛内，4 ℃过夜，再换30%的蔗糖进行脱水，沉底后立即在恒冷冻切片机内进行包埋切片，厚度为10 μm，将切好的组织片贴附在载玻片上；用PBS 洗3 次，每次5 min，擦净切片组织周围的水分（保持组织呈湿润状态），滴加封闭液（按试剂盒规定的浓度配制），置于37 ℃箱1 h；后用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加山羊抗小鼠Iba-1 一抗（1∶200），湿盒4 ℃过夜；次日，用PBS 洗3 次，每次5 min，滴加生物素标记驴抗山羊二抗（1∶200），37 ℃箱1 h；用PBS 洗3 次，每次5 min，擦去组织周围的水分后，滴含DAPI 的封片剂，盖上载玻片后，显影拍片。

1.7 酶联免疫吸附试验

LPS 注射后3 h各组采血，并行为学测试后各组取海马组织匀浆离心，取上清液；用ELISA试剂盒测试血浆TNF-α、海马Iba-1 和TNF-α 含量变化。操作方法：48 孔酶标孔加样，每孔加入标准品或待测样品各100 μL，将反应板充分混匀后置37 ℃40 min；用洗涤液将反应板充分洗涤4～6 次，滤纸印干；每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50 μL（空白除外），将反应板充分混匀后置于37 ℃20 min；用洗涤液将反应板充分洗涤4～6 次，滤纸印干；每孔加酶标抗体工作液100 μL，将反应板置37 ℃10 min，再次洗板；每孔加入底物工作液100 μL，置于37 ℃暗处反应15 min；每孔加入100 μL 终止液混匀，30 min内于酶标仪450 μm 波长测吸光值，绘制标准曲线，并根据样品A值计算相应TNF-α 和Iba-1含量。

1.8 统计学方法

采用SPSS 23.00 软件进行统计分析，结果均服从正态分布，数据用（）表示。采用方差分析进行多组间比较，多组间的两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电针百会、神庭可提高LPS诱导认知功能障碍小鼠的学习记忆能力

LPS 注射后24 h 行为学结果显示，模型组与对照组比较，“what”“when”和“where”3 种记忆出现显著下降（P＜0.01）；电针组与模型组比较，“what”和“when”2 种记忆明显改善（P＜0.01），结果采用单因素方差分析，差异均具有统计学意义。见图1。

图1 3组what-where-when行为学测试结果比较（）Figure 1 Comparison of exploring time on what-wherewhen behavior()

2.2 3组小鼠血浆TNF-α水平比较

与对照组比较，模型组小鼠血浆的TNF-α 水平显著上升（P＜0.01）；与模型组比较，电针组小鼠血浆的TNF-α 水平明显下降（P＜0.01），结果采用单因素方差分析，差异均具有统计学意义。见图2。

图2 3组小鼠血浆TNF-α水平比较（）Figure 2 Comparison of plasma levels of TNF-α in mice()

2.3 3组海马TNF-α水平比较

与对照组比较，模型组小鼠海马区的TNF-α 水平显著上升（P＜0.01）；与模型组比较，电针组小鼠海马区的TNF-α 水平明显下降（P＜0.05），结果采用单因素方差分析，差异均具有统计学意义。见图3。

图3 3组海马TNF-α水平比较（）Figure 3 Comparison of hippocampal levels of TNF-α in mice()

2.4 3 组海马区小胶质细胞活化状态及标志物Iba-1的表达比较

免疫荧光200 倍镜下结果显示，模型组相较于对照组，海马区小胶质细胞活化标志物Iba-1 表达显著增多，小胶质细胞活化后形态及数量改变明显；而电针组与模型组比较，海马区小胶质细胞活化数量显著减少。见图4。同样，ELISA结果也显示，模型组小鼠的海马区小胶质细胞活化标志物Iba-1表达显著增多（P＜0.01），而电针组与模型组比较，海马区小胶质细胞活化标志物Iba-1 表达明显减少（P＜0.05）。见图5。

图4 3组海马区小胶质细胞活化标志物Iba-1的表达比较（×200）Figure 4 Comparison of expression of Iba-1 in the hippocampal region of three groups(×200)

图5 3组海马Iba-1水平比较（）Figure 5 Comparison of hippocampal levels of Iba-1 in mice of three groups()

3 讨论

脓毒症脑病主要是由系统性炎症引起的神经炎症，从而造成脑损伤，主要表现为认知功能下降等。海马属于边缘系统的重要组成成分之一，参与高级认知功能，尤其是对学习和记忆能力的储存［8］，what-where-when 行为学测试是观察小鼠对新物体的探索能力、位置辨别能力以及时序的记忆力［19］。已有研究显示，LPS诱导全身炎症后，脑内小胶质细胞被迅速激活，小胶质细胞是脑内的常驻巨噬细胞，可造成脑内神经元的变性与死亡［20-21］。因此抑制小胶质细胞炎症反应，减少全身及脑内的炎症水平是减轻脓毒症脑病引起认知功能下降的关键。有研究证明，电针百会、神庭可控制炎症水平，改善认知功能［17，22-23］。

本研究结果显示，LPS注射后3 h，外周血TNF-α水平显著上升，而电针可明显降低其炎症发展，发挥全身抗炎作用。LPS注射后24 h，模型组对新物体的探索及时序的记忆明显受损，电针组可显著改善记忆功能。免疫荧光及ELISA 结果发现，海马区小胶质细胞活化标志物Iba-1 及TNF-α 表达明显增多，小胶质细胞异常增生，而电针组相较于模型组Iba-1、TNF-α表达降低，可抑制小胶质细胞异常增生。

因此，电针百会、神庭可以显著改善脓毒症脑病小鼠的新物体识别和时序记忆能力，并可减轻全身炎症水平，减少海马区小胶质细胞的活化，改善海马区的神经炎症反应，其作用可能通过抑制海马区小胶质细胞活化，降低外周血及海马区炎症因子TNF-α 释放，从而改善系统性炎症及其诱导的学习记忆能力下降。