针刺对脑出血大鼠血红素氧化酶1及炎性因子表达的影响

陈秋欣，孔 莹，于婷婷，张 瑜，刘 鹏，张 鑫

1 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150040；2 黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150001；3 黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨 150001；4 深圳市宝安中医院（集团），广东深圳518133

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是卒中的亚型之一，占全部卒中类型的15%～20%，其死亡率和病残率较高［1-2］。随着人口老龄化速度的加快，其发病率持续上升［3］。脑出血后多数患者遗留有运动、语言、感觉、吞咽功能的障碍，严重影响人们的生活质量。尽管近些年关于脑出血治疗的临床和实验研究有所增加，但仍未找到有效的治疗方法［4］。目前多项研究表明，血肿本身引起的机械性损伤、血肿分解产物的继发性毒性及炎性损伤是脑出血最主要的病理、生理改变［5-10］。脑出血后血红蛋白破入到脑局部引起继发性血脑屏障破坏，局灶性水肿以及神经元和神经胶质细胞凋亡等［11］。同时，脑出血引起的氧化损伤可以继续激活脑组织中炎症反应，导致大量细胞因子和炎症介质释放。血红素氧化酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是一种抗氧化酶，在氧化应激发生时起到清除氧自由基片段的作用［12-13］。核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）在脑出血炎性反应中起中心调控作用，多种炎性因子如白介素6（Interleukin-6，IL-6）、白介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等均为其下游因子，与神经细胞凋亡关系紧密［14］。

我们既往研究显示，针刺百会透曲鬓穴可以抑制TLR-4、NF-κB 蛋白的表达，降低血肿组织中促炎因子TNF-α、IL-6 的含量，减轻脑出血后炎性损伤，改善大鼠神经功能缺损，发挥脑保护作用［15-17］。但从HO-1 与炎性因子角度讨论针刺对脑出血的保护作用的研究较少。本实验采用针刺百会透曲鬓穴干预脑出血大鼠，观察针刺对血肿组织HO-1、NF-κB、IL-1β、TGF-β 蛋白表达影响，探讨针刺治疗脑出血的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF 级雄性Wistar 大鼠，8 周龄，体质量（300±20）g［吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供，动物许可证号SCXK（吉）2013-0004］。动物于人工控制条件下，温度（22±3）℃、相对湿度（60±5）%、12/12明暗变化条件下饲养。实验遵循科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。

1.2 主要试剂及仪器

HO-1多克隆抗体（bs-0827R-1，上海振誉生物科技有限公司，中国）；NF-κB兔多克隆抗体（BM3940，武汉博士德生物有限公司）；IL-1β 多克隆抗体（70-ab33591-200，杭州联科生物技术股份有限公司，中国）；TGF-β 多克隆抗体（70-ab35829-050，杭州联科生物技术股份有限公司，中国）；立体定位仪（ST-5ND-C，中国成都仪器厂）；电泳仪（DYY-7C，北京六一生物科技有限公司）。

1.3 造模方法

参照文献［18］制作脑出血大鼠模型。将大鼠用1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上，备皮消毒，正中切口，骨膜剥离器剥离骨膜，暴露前囟及冠状缝，取前囟点（Bregma 点）右旁开3.5 mm，后0.2 mm 定点，用牙科钻钻直径为1.0 mm 的圆孔，深达硬脑膜表面，鼠尾酒精消毒，距尾端3 cm 处剪断鼠尾，用微量注射器取血50 μL，将微量注射器固定于立体定位仪上，沿钻孔进针约6 mm，将未肝素化的血液50 μL以20 μL/min速度推进尾壳核，留针约5 min，缓慢出针。留针期间酒精棉球包扎鼠尾断端伤口，术后局部喷洒庆大霉素，用牙科水泥封闭颅骨伤口，缝合头皮，局部皮肤采用碘酚消毒。假手术组动物接受类似模型组的各项手术操作，但不进行注血。造模完成至大鼠清醒后，采用Berderson 评分法［19］确定动物成功模型。评分1～3分的大鼠纳入实验。

1.4 分组及干预方法

将108 只大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、针刺组。每组按1、3、7 d时间点再分为3个亚组，每组各12 只。①假手术组：接受类似模型组的各项手术操作，但不进行注血制作。②模型组：仅接受脑出血模型制作，不进行任何干预。③针刺组：制作脑出血模型。造模后12 h 开始治疗。参照《实验针灸学》［20］选取大鼠百会穴、患侧曲鬓穴，采取百会（顶骨正中）穴透刺曲鬓穴（右眶外缘与右外耳门连线的后2/3），手持针灸针（0.30 mm×25 mm，苏州安迪）快速进针，并向右下方曲鬓穴透刺，进针深度20 mm，以100 r/min小幅度捻转。每间隔5 min捻针1 次，每次持续捻转5 min，共留针30 min，每日1次。

1.5 观察指标及检测方法

术后1、3、7 d，对各组大鼠进行神经行为学评价，各组取6 只大鼠行HE 染色检测脑组织病理损伤，取6 只大鼠行Western blot 检测脑组织HO-1、NF-κB、IL-1β、TGF-β蛋白表达。

1.5.1 神经行为学评价 采用改良的神经功能缺损评分（modified Neurological Severity Score，mNSS）对3组大鼠的神经功能损伤进行检测［21-22］。

1.5.2 HE 染色检测脑组织病理损伤 灌注后，取注血中心点前后2 mm的大鼠脑组织，包埋，冠状切片，厚4 μm，每隔2 mm连续切6个脑片，HE染色，光镜下观察病理损伤。

1.5.3 Western blot 检测脑组织HO-1、NF-κB、IL-1β、TGF-β 蛋白表达 从-80 ℃冰箱取各组的脑组织，将脑组织匀浆离心后取上清液，采用BCA 法测定蛋白量。30 μL 处理后的蛋白样品采用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PACE）转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，以标准蛋白Maker 为参照，5%脱脂奶粉封闭，相应条带分别加入HO-1（1∶500）、NF-κB（1∶1 000）、IL-1β（1∶500）、TGF-β（1∶500），4 ℃孵育过夜。显色完成后，将硝酸纤维素膜移至蒸馏水中终止显色。用滤纸将膜吸干，避光放置20 min 后，将膜置于扫描仪中扫描，用凝胶图像处理系统（Gel-Pro-Analyzer软件）分析目标条带的光密度值。

1.6 统计学方法

数据采用SPSS 22.0进行统计学处理，计量资料服从正态分布均以（）表示。各时间组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组mNSS评分比较

评分前所有大鼠mNSS 评分均为0 分。假手术组术后无明显神经功能缺损表现。模型组大鼠于1 d时已表现出神经功能缺损症状，3 d和7 d时仍有明显神经缺损症状；与模型组相比，针刺组各时间大鼠神经功能评分明显降低（P＜0.01）。见表1。

表1 3组mNSS评分比较（）Table 1 Comparison of mNSS scores of rats in three groups（）

表1 3组mNSS评分比较（）Table 1 Comparison of mNSS scores of rats in three groups（）

注：与假手术组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01。Notes:Compared with the sham operation group,1)P＜0.01;compared with the model group,2)P＜0.01.

2.2 3组大鼠HE染色结果

1、3、7 d时间点，假手术组大鼠基底节区可见正常的神经细胞及胶质细胞。模型组大鼠在造模1 d后可见出血灶；术后3 d 出血灶增大，脑组织病理结构破坏明显；术后7 d 可见血肿范围减少。与模型组相比，各时间点针刺组出血灶范围缩小，脑组织病理结构破坏程度降低。见图1。

图1 3组大鼠HE染色结果Figure 1 HE staining results of rats in three groups

2.3 3组大鼠脑组织HO-1蛋白表达比较

假手术组可见HO-1 弱阳性表达。模型组HO-1 蛋白表达增高，于3 d 时间点相对表达最多。与模型组相比，于3、7 d 时间点针刺组HO-1 蛋白表达明显升高（P＜0.05）。见图2。

图2 3组大鼠脑组织HO-1 Western blot结果Figure 2 HO-1 Western blot results of brain tissue of rats in three groups

2.4 3 组大鼠脑组织NF-κB、TGF-β 和IL-1β 蛋白表达比较

假手术组均可见NF-κB、TGF-β 和IL-1β 弱阳性表达；各时间点模型组NF-κB、TGF-β和IL-1β蛋白表达明显增高，于3 d 时间点相对表达最多；与模型组相比，针刺组在1、3、7 d 时间点NF-κB、TGF-β和IL-1β蛋白表达明显降低（P＜0.05）。见图3～5。

图3 3组大鼠脑组织NF-κB Western blot结果Figure 3 NF-κB Western blot results of brain tissue of rats in three groups

图4 3组大鼠脑组织TGF-β Western blot结果Figure 4 TGF-β Western blot results of brain tissue of rats in three groups

图5 3组大鼠脑组织IL-1β Western blot结果Figure 5 IL-1β Western blot results of brain tissue of rats in three groups

3 讨论

脑出血属于中医“中风”范畴，针灸治疗中风在临床应用多年，并取得较好的临床疗效［23］。一项Meta 分析表明针灸治疗脑出血急性期疗效肯定［24］。早在春秋战国时期，已有扁鹊取穴三阳五会即百会穴用来治病的案例。古籍《乾坤生意》中对于中风病的治疗无论是风邪入腑还是风邪入脏均选用百会穴治疗。曲鬓穴，属足少阳胆经。采用百会透刺曲鬓穴，这一穴区横跨顶、额、颞3 区，此区内含督脉、足太阳膀胱经及足少阳胆经，其经络调节可纵贯全身，主治中风、脑病、感觉不利等。临床研究亦表明针刺百会透曲鬓穴能够改善中风患者的神经功能缺损程度，提高临床疗效［25］。实验研究也表明早期针刺能促进血管新生及神经再生，且较长针刺时间对脑出血后血脑屏障有正向保护作用，说明针刺能够起到脑保护的作用［26-27］。

脑出血后脑损伤的病理生理机制十分复杂，目前主要分为原发性损害和继发性损害。原发性损害是指血肿对局部脑组织破坏，继发性损害是指脑出血后脑组织对血肿及其释放的血酶、血红蛋白等化学物质，进一步导致脑组织水肿、炎性反应以及细胞凋亡等［28-29］。脑出血后，大量血红蛋白破入脑实质，血红素作为血红蛋白分解产物能够产生氧自由基和氧化应激反应，介导神经元死亡［30］。

作为人体内血红蛋白分解产物——血红素分解的限速酶，HO-1 发挥着重要作用，诸多研究均已证实，通过不同药物或途径激活HO-1 的活性，均能使其炎症损伤减轻，反之，抑制其活性则能够加重神经损伤［31-32］。目前对于HO-1 在脑出血中作用仍存在争议，WANG 等［33］实验结果表明HO-1 在脑出血中同时发挥抗氧化和促氧化作用。脑出血后第1～7天HO-1表达的增加起到了保护作用，而7 d后HO-1 的过度表达则可加重神经功能损伤。另一项研究发现在脑出血早期即可触发HO-1 的神经保护作用，可能与HO-1 诱导的Nrf2 和NF-κB 进入细胞核的调节有关［34］。亦有研究表明HO-1通过抑制炎症因子的表达来抑制NF-κB 的活化［35］。由此可见，HO-1与NF-κB 及相关炎性因子存在紧密又复杂的关系。

多年来，炎性反应一直是脑出血的重要病理生理机制［36-37］，作为具有多种功能且广泛存在的一种核转录因子，NF-κB 静息状态下无活性状态，当机体受到如应激反应、炎症、细胞因子等刺激后，NFκB 即可解除抑制而被活化释放，迅速进入细胞核，启动特异靶基因的转录。可将NF-κB 看作炎症介质基因转录的启动开关，能够触发多种细胞因子和黏附分子等的表达，如IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-6等［38-39］。多项动物实验研究表明炎症反应介质IL-1β、TGF-β与脑出血后继发性脑损害密切相关［40-45］。

本实验通过mNSS 评分法观察到模型组脑出血大鼠各时间点（1、3、7 d）出现不同程度神经功能缺损症状，在术后第3 天时模型组大鼠神经缺损症状相对最重，评分最高。直至术后7 d大鼠神经功能缺损症状减轻。针刺组大鼠各时间点（1、3、7 d）神经功能评分与模型组相比明显降低，说明针刺能够降低脑出血大鼠神经功能评分，改善神经功能缺损表现。模型组造模1 d 后出现血肿，周围组织破坏明显，术后3 d 可见出血灶范围增大，7 d 时出血灶减小，脑组织水肿减轻；针刺组大鼠在各时间点与模型组比较病变程度均有所减轻，说明针刺可以有效地减轻脑出血大鼠的脑组织病理炎性损伤。Western blot 结果可见模型组HO-1、NF-κB、IL-1β、TGF-β蛋白表达均不同程度增高，相比模型组而言，针刺组各时间点（1、3、7 d）HO-1 蛋白表达增高，与模型组相比差异有统计学意义，说明针刺可以促进HO-1的表达；而针刺组各时间点（1、3、7 d）NF-κB、IL-1β、TGF-β 蛋白表达明显减少，与模型组相比差异有统计学意义，说明针刺能够抑制NF-κB、IL-1β、TGF-β蛋白表达。

综上，针刺百会透曲鬓穴可能通过上调HO-1的表达，抑制NF-κB、IL-1β、TGF-β 蛋白表达，降低病理炎症损伤，改善神经功能缺损表现，发挥脑保护作用。但针刺如何通过HO-1调控NF-κB介导的信号通路及其下游因子表达，以及HO-1 在脑出血中具体发挥什么样的作用，仍需要人们进一步的深入研究，以期为临床改善脑出血患者的治疗找到新的思路。