植物多糖的分离研究进展

柯钦豪，马慧敏，曹 琴，王世越，周宏福，郑 敏

(湖北科技学院，湖北 咸宁 437100)

植物多糖由十个以上单糖通过糖苷键连接而成，能通过水提取、超声波提取、碱提取、酶辅助提取、微波辅助提取和超临界流体萃取[1]等方法获得。研究报道，植物多糖具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗氧化[2]等多种生物活性，现已广泛应用于医疗保健行业。但提取纯化后的植物多糖仍然是一个含有多种多糖的混合体系，对后续的定性等结构表征分析及生物活性分析带来很大的影响，所以，植物多糖的分离为多糖研究的重要部分。目前为止，植物多糖的分离分为初步分离和精细分离，初步分离的方法包括盐析法、分级沉淀法、膜分离法等；精细分离的方法包括凝胶柱色谱法、离子交换柱色谱法、离子交换柱色谱和凝胶柱色谱联用法、亲和色谱法、高效逆流色谱法等。我们以近十年植物多糖分离的相关研究成果作为基础，对植物多糖的分离进行综述，为深入研究提供科学依据。

1 初步分离

多糖是聚合程度不同的物质的混合体系，其分子量范围从几千到几千万，其纯度用“均一多糖”来表示，不同于一般化合物，“均一多糖”为一定分子量范围的均一组分，代表某一多糖的相似链长的平均分布。

多糖的分离就是将多糖这一混合体系分离成成分更加均一的多糖，其中分离方法较为粗犷的为初步分离，主要有盐析法、分级沉淀法、膜分离法等。

1.1 盐析法

盐析法分离多糖常用到季铵盐，季铵盐为一种乳化剂，在水中能形成阳离子，可与酸性多糖阴离子形成不溶于水的沉淀，再经过过滤就得到了中性及碱性多糖溶液和酸性多糖沉淀，再向溶液中加入碱性物质如硼砂缓冲液，则中性多糖沉淀，最终可以得到酸性多糖、中性多糖及碱性多糖。

盐析沉淀后，可以取沉淀和上清，分别浓缩，得到两个多糖组分，如张瑞妮等[3]将提取得到的柿子多糖与3%的十六烷基三甲基胺溴化物(CTAB)混匀，静置得到沉淀和上清两个多糖组分。秦垂新等[4]以中药口服液为原料，利用CTAB沉淀法，得到了沉淀酸性多糖组分和上清中性多糖组分。还可以沉淀后只取沉淀的多糖组分，如何伟珍等[5]用季铵盐沉淀法分离银耳多糖。沉淀多糖的物质也可以是十六烷基三甲基胺溴化物(CTAB)的碱(CTA-OH)和十六烷基吡啶。同样可以用硫酸铵、氯化钠、氯化钾、醋酸钾等进行盐析分离多糖。还有金属络合物法，也可以将多糖沉淀出来，如用费林溶液、氯化铜、氢氧化钡、醋酸铅等[6]。盐析法操作简单，节约成本，根据多糖酸碱性分离多糖，但不足之处是分离后得到的多糖组分均一性不够高，只适用于多糖的初步分离。

1.2 分级沉淀法

多糖在甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂中的溶解度与多糖的分子量、聚合度及有机溶剂的浓度等因素有关，有机溶剂会破坏多糖的氢键，进而破坏多糖的二级结构，使多糖的溶解度降低。一般随着有机溶剂浓度的增加，多糖会按分子量从大到小依次被沉淀下来，这种分离多糖的方法就叫分级沉淀法。

乙醇毒性小且可回收，为分级沉淀法较常用的有机溶剂。景永帅等[7]向热水浸提的多糖浓缩液中加入一定体积的乙醇，使乙醇终浓度为30%、50%及70%，依次得到了不同乙醇浓度下沉淀的多糖。分级沉淀法的特点与盐析法类似，分离后得到的多糖组分均一性不够高，不同之处为分级沉淀法分离得到的多糖分子量接近，而盐析法分离得到的多糖酸碱性接近。

1.3 膜分离法

以选择透过性膜为分离介质，多糖或其中的杂质在压力差、化学位差或电位的推动力作用下，将能透过膜的和不能透过膜的成分分开。根据选择透过性膜孔径由大到小可分为微滤、超滤、纳滤和反渗透膜。其中超滤还可以进一步选择可通过的物质的分子量，进而对多糖进行分离，而且还可以除去粗多糖中的盐及小分子物质。

Du 等[8]通过微孔超滤系统，用500、100、10kDa分子量的选择透过性膜对多糖进行过滤，依次得到了较纯的银耳多糖组分TAP50w、TAP10-50w、TAP1-10w。还可以通过微滤法，除去粗多糖中比膜孔大的微粒及微生物。膜分离法成本低，操作简单，节能环保，可在室温下进行，缺点是部分多糖对滤膜有一定的吸附作用。

2 精细分离

2.1 凝胶柱色谱法

凝胶是一种特殊的分散体系，其中，胶体粒子或高分子形成空间网状结构，结构间隙充满了作为分散介质的液体。凝胶又可分为弹性凝胶和脆性凝胶。弹性凝胶失去分散介质后体积显著缩小，吸收分散介质后体积又显著膨胀，如明胶、聚酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚酰胺葡聚糖凝胶、葡聚糖琼脂糖凝胶等，这类凝胶使用前常需要进行活化及缓冲液浸泡。脆性凝胶失去或吸收分散介质，其性状和体积均不发生改变，如硅胶等。凝胶根据分子筛原理分离物质，含有各种分子的样品溶液缓慢流经色谱柱时，大分子物质由于直径较大，只能通过颗粒之间的间隙向下移动，速度较快。小分子物质还可进入凝胶颗粒的微孔中，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒的微孔，速度较慢，即小分子物质的下移速度慢于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，分子小的后流出。

2.1.1 琼脂糖凝胶柱色谱法

琼脂糖是半乳糖的线性多聚物，溶于水后在35℃～40℃时形成良好的半固体状凝胶。Lin等[9]通过Sepharose 6B凝胶柱色谱法将番石榴种子粗多糖分离出了3种蛋白质多糖。琼脂糖还为一种强阴离子型凝胶，能够结合酸性多糖。琼脂糖不但能将脂多糖和一般多糖分离，还能够将脂多糖与色素进行分离，如陈正行[10]分离米糠多糖得到了纯度99.5%纯度的米糠脂多糖。崔杰等[11]将得到的莼菜多糖1和莼菜多糖3进行纯化时使用琼脂糖凝胶柱Sepharose CL-6B，证明了莼菜多糖1和莼菜多糖3组分较为均一。

2.1.2 葡聚糖凝胶柱色谱法

葡聚糖凝胶是葡聚糖和甘油基交联形成的一类凝胶。梁宇芝等[12]将羊肚菌胞内多糖与胞外多糖分别用葡聚糖凝胶G-100柱分离，均得到了5个多糖组分。吴金松等[13]将得到的信阳毛尖茶多糖用浓度梯度的NaCl洗脱Sephadex-G100葡聚糖凝胶柱，得到了3个多糖组分，然后再用Sephadex-G150葡聚糖凝胶柱进行多糖纯度的鉴定，最终得到了一种纯度为92.4%的多糖。琼脂糖凝胶柱色谱法和葡聚糖凝胶柱色谱法所需设备简单、操作方便、不需有机溶剂，且对多糖及其他高分子物质有很好的分离效果，应用广泛。

2.2 离子交换柱色谱法

DEAE(二乙基氨基乙基)与不溶性的葡聚糖、琼脂糖或纤维素等交联结合后，形成DEAE-纤维素和DEAE-琼脂糖凝胶等，DEAE在水中可形成不溶性的阳离子物质，对不同多糖在水中电离产生的阴离子的吸引力不同，通过增强洗脱溶剂的离子强度或改变洗脱溶剂的pH值，可以依次按与离子交换柱吸引力从弱到强的顺序洗脱出不同的多糖。此方法适合用来分离中性多糖和酸性多糖，常用的洗脱溶剂为浓度梯度的NaCl水溶液等。

DEAE-纤维素适合用来分离酸性多糖、中性多糖和粘多糖，多糖对DEAE的吸附力随着多糖酸性基团的增多而增强，用浓度梯度的盐溶液或碱性溶液洗脱，即可依次得到不同酸性的多糖。Li等[14]通过DEAE-52纤维素色谱柱，分别用0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8mol/L的NaCl溶液洗脱热水浸提、超声辅助提取及酶提取法提取得到的kurome昆布多糖，均得到了6个多糖组分。

刘卫宝等[15]将得到的黄芪粗多糖用DEAE琼脂糖凝胶柱DEAE Fast low进行分离，得到了两个纯化的多糖组分。孟祥勇等[16]将得到的黄酒多糖用DEAE-Sepharose FF色谱柱进行分离纯化，得到了3种黄酒多糖组分。这种分离多糖的方法污染小，分离出来的多糖纯度高，不足之处是洗脱液体积大，后处理较为麻烦费时。

2.3 离子交换柱色谱法和凝胶柱色谱联用法

近年来越来越多的文献报道，先通过DEAE色谱柱将植物多糖分离成若干个组分，然后再用凝胶柱色谱法进行进一步的分离或纯化。如裴若楠等[17]先用DEAE-52离子交换层析柱分离得到石花菜多糖1，然后用Sephadex G-200层析柱进一步纯化多糖。这种两种色谱柱联用的方法，能得到分离更彻底的多糖组分，分离效果佳，得到的多糖组分多为均一多糖。

2.4 亲和色谱法

生物分子间存在很多特异性的结合力，这样一对的分子常称为配体与受体，配体与受体的这种结合力又被称为亲和力。亲和色谱就是将配体以共价键固定在不溶性基质中，再将不溶性基质装填成色谱柱，用含有受体的溶液洗脱色谱柱时，受体会被吸附在固定相上，其他物质被洗脱下来，再用适当的洗脱液将受体洗脱下来，就得到了只含有受体和洗脱液的物质，进而分离得到只含有受体的单一成分。

王启龙[18]首先将酰化的CNTm(复壁碳纳米管)与硅烷化的硅胶(SiO2)反应制成CNTm@SiO2复合物，然后将人单核细胞诱导产生的巨噬细胞(Mφ)通过蔗糖浓度梯度溶液超速离心法获得脂筏，冰水浴条件下向Mφ脂筏溶液及XOD(黄嘌呤氧化酶)中加入CNTm@SiO2复合物，就分别得到了Mφ@CNTm@SiO2和XOD@CNTm@SiO2亲和色谱柱装柱材料。低压装柱后，筛选多糖的免疫活性，分别筛选出了7种与Mφ及XOD有免疫活性的植物多糖。路垚等[19-20]发现金银花多糖能与凝集素发生凝集反应，推测能与凝集素发生凝集反应的就是活性多糖，于是以蓖麻油凝集素为亲和载体，制备亲和色谱柱，并得到了由3种不同分子量混合而成的亲和活性多糖。亲和色谱法除了可以用来分离多糖，还可以除去多糖中特有的杂质，如张娟娟等[21]用Affi-Prep Polymyxin柱亲和色谱除去鱼腥草总多糖中的内毒素。亲和色谱法的优点是分离得到的多糖组分有较好的同等生物活性，适合用来进行生物活性实验，缺点是色谱柱的制作较为复杂，技术难以掌握，所以使用并不广泛。

2.5 高效逆流色谱法

高效逆流色谱法发展自多级萃取技术，通过自转和公转(同步行星式运动)产生的二维力场使两相容剂萃取频率及效率大为提高。不相溶的上下两相平衡溶液在螺旋管内交替分布，当螺旋管高速转动时两相溶液分别占据螺旋管的两端(首端与尾端)，将首端溶液从尾端注入后会迅速回到首端，不断地进行萃取，最终根据分配系数的不同实现样品的分离[22]。现有的高效逆流色谱仪上样量从数十微克到数十克不等，且其分析能力可与高效液相色谱相媲美，现已广泛应用于花色苷、多糖及其他天然产物的分离纯化[23]。

Yu等[24]利用高效逆流色谱纯化Anoectochilus roxburghii(wall)多糖，得到了纯度为95.01%的多糖。王晓丽等[25]根据分配系数测定实验，得出了当聚乙二醇∶磷酸二氢钾∶磷酸氢二钾∶水比例为5∶15∶15∶65时加入2%NaCl，可分离芦荟粗多糖得到两个多糖组分，经葡聚糖凝胶柱色谱及凝胶渗透色谱分析，确定这两个多糖组分的成分均一。此方法不会用到任何的固态支撑体，不会造成样品被污染、生物活性改变，而且避免了分离的物质被固相载体吸附导致样品的损失，并且有机溶剂使用少，可同时实现纯化和分离，具有重现性好、操作简单、用时较短的优点。

3 展 望

通过综述以上多糖的分离方法，发现各有特点。盐析法和分级沉淀法分离操作简单，所用耗材试剂常见，但其分离的组分常纯度不够，无法得到均一多糖。膜分离法操作简单，分离效果也较好，但对多糖有一定的选择性，部分多糖容易黏附膜孔，采用此法时分离效果不佳。凝胶柱色谱法分离效果较好，能分离出不同分子量范围的多糖，现已广泛应用。离子交换柱色谱法可以根据多糖酸碱性的不同分离多糖，也较常用。凝胶柱色谱法及离子交换柱色谱法分离多糖效果均较好，常进行联用，以取得更好的分离效果，现应用较广泛。亲和色谱法为近年来发展起来的根据多糖对生物细胞或组织的亲和特性，将多糖进行分离，分离效果好，并且尤其适合用分离出来的多糖进行生物实验，但缺点是色谱柱的制作方法较为复杂，难以掌握。高效逆流色谱法分离多糖的方法用时较其他方法较为短暂，并且分离效果好，重现性好，但缺点是分离设备昂贵，难以普及。

随着近年来植物多糖被研究得越来越深入，多糖在医疗上的价值越来越高。但多糖是一类结构复杂的生物大分子，为聚合程度不同的物质的混合物，而且多糖还可以与蛋白质、油脂类以糖苷键结合成为糖蛋白、脂多糖等。所以，操作简单、分离效果好的多糖分离方法尤为关键。随着各种多糖分离技术在研究中的应用，越来越多具有生物活性的多糖被发现并进行分离纯化，相信随着对多糖研究的进一步深入，多糖的结构及药效关系会取得进一步的阐明，植物多糖的开发和应用会得到不断拓宽和发展，以便于更好地应用于食物、保健及医药领域。