细胞焦亡与肺部疾病的研究进展*

周其其，闵 清**，白育庭

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院临床医学院)

细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)是一种由基因调控的细胞死亡方式，它包括细胞凋亡(apoptosis)、细胞坏死(necrosis)、细胞焦亡(pyroptosis)、铁死亡(ferroptosis)、自噬(autophagy)和胞葬(efferocytosis)6种方式[1]。自2001年Cookson提出并定义了细胞焦亡是一种新的细胞程序性死亡后，细胞焦亡受到大家的广泛关注，据现阶段文献报道，细胞焦亡已涉及癌症[2]、炎症[3]、癫痫[4]、脓毒症[5]等疾病的病变过程。研究表明，细胞焦亡在肺部疾病的发生发展中同样具有重要的作用，包括肺癌、慢性阻塞性肺疾病、肺部炎症以及肺结核。本文回顾近年来相关报道，对细胞焦亡在肺部疾病中的作用进行综述。

1 细胞焦亡的概述

细胞焦亡是一种新型细胞程序性死亡，常伴随着炎症的发生，故又称为细胞炎性坏死。细胞焦亡早期会出现染色质浓缩和DNA断裂，之后细胞膜会形成大量坏死性孔隙，导致细胞膜丧失其完整性，一方面使得钙离子和水进入细胞内，另一方面大量的细胞内含物和炎性因子向外漏(如IL-1β，IL-18等)，最终导致细胞破裂而发生焦亡。与细胞凋亡相比，虽然两者都将发生核皱缩与DNA断裂，但两者本质区别在于细胞凋亡时细胞膜是完整的，不会释放出炎性因子，而细胞焦亡则相反。故细胞焦亡具有独特的分子机制与应用，具有研究价值。

2 细胞焦亡的分子机制

细胞焦亡与Caspases家族密切相关，Caspases家族为一种高度保守的天冬氨酸特异性半胱氨酸家族，目前已经有超过10个以上的成员。细胞焦亡最初被认为是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-1)介导的细胞死亡，随着研究的深入，发现Caspase-3、4、5、8和11也能介导细胞发生焦亡。目前主流观点认为细胞焦亡发生的机制主要分为Caspase-1依赖的经典途径和Caspase-3、4、5、8和11依赖的非经典途径。另外，有学者将细胞焦亡称为由Gasdermins(GSDM)介导的炎性PCD，GSDM蛋白家族是介导细胞焦亡的一组重要蛋白，其在诱导细胞死亡和炎症中具有重要作用。Caspases被激活后切割GSDM蛋白家族，GSDM释放N末端结构域识别并在细胞膜上打孔，其改变了细胞渗透压，使膜内外电解质失衡引起细胞肿胀破裂，进而释放大量炎性因子和细胞内容物，招募免疫细胞进一步扩大炎症反应，使细胞发生炎症性死亡[6]。

2.1 细胞焦亡的经典途径

Caspase-1依赖的细胞焦亡经典途径，其关键蛋白与炎性小体紧密相关，炎性小体复合物是天然免疫防御过程中的重要组成部分，Caspase-1在细胞质中是以无活性的酶原形式(pro-caspase-1)存在，而炎性小体可以将其激活而发挥作用[7]。炎性小体是由模式识别受体(particular pattern recognition receptors,PRRs)作为支架蛋白构成的大分子蛋白质复合物[8]，主要包括4个主要原型NLR家族的吡啶域,即NLRP1、NLRP3、NLRC4、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)和吡啶(Pyrin)，这些炎症小体通过各种刺激诱导焦磷酸化而使细胞发生焦亡。NLRP3作为细胞焦亡研究最广泛的炎性小体之一而备受关注，其受体蛋白含有PYD、NACHT和LRR三个结构域，可以被一系列微生物和宿主来源的触发因素激活，包括细菌、病毒和成孔毒素等。NLRP1介导的炎性小体是第一个被识别的分子平台，可触发Caspase-1激活人类巨噬细胞中IL-1β的分泌，主要参与针对炭疽芽孢杆菌的宿主防御机制[9]。与NLRP1类似，NLRC4(也称为IPAF，CLAN和CARD12)包含CARD，可以直接与Caspase-1的CARD域相互作用，能被病原菌激活，是入侵细菌的关键胞质监视系统[10]。AIM2主要在细胞质中表达，属于HIN-200家族，能够通过PYD结构域和ASC相互作用，感测胞质细菌双链DNA，AIM2感应DNA是非特异性的识别，当细菌病原体入侵后可以激活Caspase-1，导致细胞焦亡，这在感染和慢性炎症中发挥着作用[11]。

2.2 细胞焦亡的非经典途径

细胞焦亡非经典途径中，革兰氏阴性细菌产生的外膜囊泡(OMV)将细菌脂多糖(LPS)分子传递到细胞质中，并在体内和体外触发人细胞中的Caspase-4或Caspase-5或在小鼠细胞中的Caspase-11依赖性效应反应。在LPS的作用下，裂解的Caspase-4或Caspase-5和Caspase-11也能激活Gasdermin-D在细胞膜上形成孔，然后在细胞外释放IL-1β和IL-18，导致细胞焦亡的发生[12]。同时，Gastermin-D的N端片段激活NLRP3炎性体并通过经典途径诱导细胞焦亡[13]。

2.3 GSDMD蛋白

GSDM蛋白家族由GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和DFNB59组成[14]，其中，GSDMD是细胞焦亡的关键蛋白，参与了细胞焦亡的经典途径和非经典途径。活化的Caspase-1和Caspase-11能够在Asp276位点上切割GSDMD形成N端和C端两个片段，即GSDMD-NT和GSDMD-CT，前者为主要的功能结构域，参与细胞的焦亡，后者具有自体抑制功能。重组的GSDMD可被视化为脂质体上的孔状结构，这些孔可以使焦磷酸细胞的胞质内含物流出[15]，具体体现在当GSDMD被切割后，GSDMD-NT可能通过Caspase移除GSDMD-CT的抑制性结构域而从单体变成寡聚物转移至细胞膜，GSDMD-NT与膜上的磷脂酰肌醇、磷脂酸和磷脂酰丝氨酸连接而发生低聚化，产生气孔使得炎症因子很容易通过细胞膜，导致细胞发生肿胀最终诱导细胞焦亡。另外，也有研究表明[16]，Caspase-8也可以切割GSDMD诱导细胞发生焦亡。

3 细胞焦亡与肺部疾病之间的联系

肺是人体中气体交换的主要器官,在呼吸过程中，肺部可能遭受各种环境侵害，包括暴露于烟雾和微粒和病原体(如细菌、病毒和真菌)形式的异物。因此，气道细胞(如肺泡巨噬细胞)常暴露于这些损伤下，可引发炎性体介导的免疫反应，单独或与易感遗传因素结合会导致肺脏发生病理改变[8]。越来越多的证据表明炎性小体在各种肺部疾病的发病机理具有关键作用，尽管炎性体介导的免疫反应(包括焦磷酸化和细胞因子分泌)对于宿主防御至关重要，但过量的炎性体介导的免疫反应会加剧组织损伤。

3.1 细胞焦亡与肺癌

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，是全球范围内与癌症相关死亡的主要原因，其预后不佳且5年生存率低于15%[17]，根据细胞起源和表型可将肺癌分为小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，其中，NSCLC占肺癌病例的85%。Wang 等[18]研究辛伐他汀治疗非小细胞肺癌可以通过激活NLRP3/Caspase-1/IL-1β和/IL-18而导致细胞焦亡，后续研究也建立了异种移植小鼠模型，结果表明，辛伐他汀通过激活Caspase-1诱导的焦亡来抑制异种移植小鼠模型中NSCLC肿瘤的生长，这为辛伐他汀作为抗肿瘤药提供分子机制参考。Li 等[19]研究新型派隆清(PL)类似物L50377，除了比PL有更大的抑制癌细胞生长的潜力外，还发现L50377可以刺激细胞中活性氧(ROS)的生成，而ROS是维持细胞氧化还原稳态的活性小分子，可以介导焦亡、凋亡等各种细胞程序性死亡；该研究进一步发现ROS介导的NF-κB抑制与L50377诱导细胞焦亡的机制有关，但是否与细胞焦亡的其他途径相关并未阐明。Zhang 等[20]通过体内和体外研究肿瘤抑制基因(p53)对NSCLC细胞焦亡的机制时发现p53表达水平与NSCLC细胞焦亡呈正相关，即p53的过表达增加了焦磷酸化水平，包括mRNA和蛋白质水平上的NLRP3，ASC和Caspase-1的上调，此外，使用了p53激动剂来激活p53，并且获得了类似的结果；另外，该研究还用LPS处理人类肺癌细胞A549，结果表明LPS提高了p53水平，形成的NLPR3显著增加，从而诱导细胞发生焦亡发生。尽管如此，p53作为细胞焦亡的关键因子还需要做进一步全面的研究。

3.2 细胞焦亡与慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是由呼吸道暴露于吸入刺激物(例如香烟烟雾)引起的，并导致呼吸道进行性炎症性疾病，炎性体与COPD的发病机理密切相关，尤其是NLRP3研究较多。Wang 等[21]探讨了全身和局部气道NLRP3激活与COPD急性加重(AECOPD)之间的相关性，实验包括32位吸烟者，65位AECOPD患者，50位处于恢复期COPD患者和30位处于稳定期COPD患者，结果表明与吸烟者相比，AECOPD患者发现NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-18、IL-1β的mRNA水平明显升高，当同一组中的COPD患者变得临床稳定时，这些NLRP3炎性体介质明显减少，表明了全身和局部气道NLRP3炎性小体激活与急性加重有关，NLRP3可成为COPD患者急性加重和临床诊断的生物标志。Colarusso 等[22]研究炎性小体在COPD中的作用时提及NLRP3激活与COPD中气道炎症有关，而NLRP3炎性体激活剂中包括香烟烟雾，该文章指出NLRP3可能作为COPD发病机理中炎症反应与免疫反应之间的联系，但炎症激活的确切机制仍不清楚，需要进一步研究。Yang 等[23]研究NLRP3在COPD过程中的作用时发现在COPD的小鼠模型中，NLRP3基因的缺乏阻止了长期吸烟的小鼠中COPD的发展，因此，作者提出NLRP3炎性体对于COPD的发展至关重要，而NLRP3的阻断是COPD的一种可能的治疗策略。

3.3 细胞焦亡与肺部炎症

作为病原体传感器，炎性体复合物在宿主防御肺部感染中具有特别突出的作用。当肺部感染细菌性肺炎时，细菌颗粒会提供胞质病原相关分子模式(pathogen associated molecular，PAMP)，其与肺巨噬细胞上的NLR结合并激活不同的炎症小体复合物，从而导致IL-1β和IL-18的产生。除了触发肺中的炎性细胞因子外，多种炎症小体复合物还引发焦磷酸化[24]。He 等[25]探讨了LPS诱导的IL-1β释放和白细胞介素-1受体I型(interleukin-1 receptor I type，IL-1RI)上调对肺部炎症发展的影响，该研究证明在肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)中，LPS-TLR4信号不仅激活NLRP3炎性小体，导致细胞释放IL-1β，而且也可通过MyD88和NF-κB依赖性信号上调AM表面的IL-1RI表达。因此，上调的IL-1RI使AM对IL-1β敏感并导致焦小体形成，进而导致AM焦磷酸化，这是一种Caspase-1依赖性炎性细胞焦亡。该研究证明了IL-1β-IL-1RI信号的继发上调是AM焦亡和LPS应答引起肺损伤的重要原因。Ceballos-Olvera 等[26]用了大量的实验探讨了假小芽孢杆菌与炎症小体的相互作用，采用类鼻疽病的基因敲除小鼠模型，结果显示两种不同炎症小体被假性麦芽孢杆菌感染激活，一种是Nod样受体NLRP3，可介导IL-1β和IL-18；另一种是NLRC4的NLR，可介导焦磷酸化，细胞焦亡和IL-18的产生对抵抗假芽孢杆菌同样重要。NLRP3和NLRC4炎性小体在类鼻疽病中具有独有的作用，NLRC4主要在感染的早期和诱导细胞焦亡，而NLRP3主要调控IL-1β和IL-18的分泌。Zhao 等[27]提出当免疫功能低下的宿主暴露于革兰氏阴性细菌(如铜绿假单胞菌)时，肺巨噬细胞中Caspase-1通过NLRC4炎性小体复合物被激活，使得IL-1β和IL-18增加，最终导致细胞死亡。

3.4 细胞焦亡与肺纤维化

肺部纤维化疾病不是特定的疾病实体，而是代表不同病理过程的异质集合的最终结果。肺纤维化的发展与年龄的增加密切相关，大多数病例是发生在50岁以上的中年人，肺纤维化早期，肺部炎症表现为各种炎症细胞浸润，肺泡巨噬细胞活化，毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤[28]，Hussain 等[29]研究发现多壁碳纳米管MWCNT以时间和剂量依赖性方式诱导HBE细胞中NLRP3炎性体依赖性焦亡，来自MWCNT处理的HBE细胞的条件培养基诱导人肺成纤维细胞中促纤维化标记物(如TIMP-1、腱生蛋白C、前胶原1和骨桥蛋白)的mRNA表达显著增加，而TGF-β的表达却没有随之变化。当将IL-1β、IL-18和IL-8中和抗体添加到条件培养基中或使用来自NLRP3 siRNA转染的HBE细胞的条件培养基时，促纤维化标记物的诱导显著降低，表明NLRP3可能参与了肺纤维化的发生发展。王鹏飞等[30]研究黄芪甲苷对特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)小鼠时测定了Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达，结果表明黄芪甲苷能降低Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表达的表达水平，其机制可能与抑制细胞焦亡有关。

3.5 细胞焦亡与肺结核

结核病是由结核杆菌引起的慢性传染病，结核杆菌主要入侵肺部，称为肺结核。目前，由结核分枝杆菌感染引起的结核病仍然是全球公共卫生的威胁，Gong 等[31]研究了结核分枝杆菌PPE60在分枝杆菌的存活中发挥作用，并且这种能力与LUBAC、NF-κB信号传导和宿主细胞焦亡有关，该研究分别测定了细胞凋亡与细胞焦亡的相关蛋白，发现Caspase-1/4、NLRP3和GASDERMIND的mRNA水平显著增加，而与线粒体破裂相关的标记蛋白Mfn2未出现明显增加，表明Ms-PPE60可能促进细胞焦亡而不是细胞凋亡。Danelishvili 等[32]研究结核分枝杆菌在被吞噬细胞摄取后会过表达操纵子Rv3361c，可分泌Rv3364c，Rv3364c蛋白与膜上的丝氨酸蛋白酶组织蛋白酶G结合，抑制Caspase-1激活，从而抑制宿主细胞的焦亡。另外，也有学者提出肺结核与多种细胞死亡方式有关，结核分枝杆菌可通过细胞凋亡、细胞坏死、自噬和细胞焦亡等方式影响细胞[33]。

4 展 望

肺脏作为人类的呼吸器官，关于治疗肺部相关疾病有非常重要的意义，而肺部疾病的发生发展却是非常复杂的病理过程，其发病机制错综复杂，细胞焦亡在作为近年来新型的细胞程序性死亡方式，其肺部疾病的研究中备受关注。特别是炎性小体，但炎性小体的强大免疫功能可能是有益的或有害的，根据不同的肺部疾病可能其功能是不一致的，因此，需要在其临床背景下考虑该途径的治疗作用。鉴于细胞焦亡在疾病的发病机理中具有广泛而有效的作用，因此，进一步研究细胞焦亡的确切机制可能为治疗和诊断多种肺部疾病提供新的可能性和新的靶点。