海藻糖对糖尿病小鼠胰腺凋亡及焦亡作用*

晏晓君，邱 鹏，查文良，余 薇，周 云**

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院临床医学院)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种因胰岛素绝对或相对不足而导致的以长期血糖水平增高为特征的代谢性疾病。根据调查显示，目前全球有4亿多DM患者，中国已成为仅次于美国DM有关的保健支出总额最多的国家，DM经济负担严重[1]。DM的危害主要来自并发症，且会导致高致死率和高致残率。而DM中常见的特征为胰岛素抵抗、高胰岛素血症、β细胞功能障碍及衰竭等。目前对DM的治疗以调控血糖为主，但随着用药时间的延长，耐药性的出现，降糖效果不佳，引发组织损伤并导致功能改变。因此，在DM环境中开展药物治疗作用的研究，为新的治疗方法提供可靠的实验依据尤为重要。

海藻糖(trehalose，TLS)为非还原性二糖，广泛存在于各种生物体中，对生物活性物质具有非特异性的保护作用[2]。TLS可通过抑制炎症和蛋白水解因子的表达，恢复眼表完整性以及干燥环境下的眼睛角化[3]。TLS还可通过抑制线粒体功能障碍和激活Bcl-2家族中关键的促凋亡成员而阻断高糖诱导的神经细胞凋亡[4]。有研究报道[5]，TLS在很大程度上可使小鼠脂质代谢正常化，并减轻胰腺炎反应。我们前期研究发现，在引起DM心肌病的因素中，心肌细胞凋亡是重要发病环节[6]。基于此，本研究以小鼠腹腔注射STZ诱导DM模型，探讨TLS对胰腺功能的影响，以及改善高糖小鼠凋亡和焦亡的作用机制，为预防和治疗DM诱导的胰腺损伤提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性C57BL/6J小鼠60只，5～6周龄，体质量20～25g，由湖北省实验动物研究中心提供，动物合格证号：SCXK(鄂)2015-0018。确保饲养房温度20℃～25℃，相对湿度为(40±5)%，通风，进行光照昼夜循环，标准动物饲料和饮用水喂养，适应环境1周后，开始进行实验。

1.1.2 药品与试剂

TLS购于武汉汉宇飞扬科技有限公司；链脲佐菌素(streptozocin,STZ)购自Sigma公司；Bax、Cleaved-Caspase-3、Bcl-2抗体购于Cell Signaling Technology公司，NALP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β抗体购于北京博奥森公司。其余均为进口或者国产分析纯化学试剂。

1.1.3 实验设备与仪器

多功能酶标仪(瑞士TecanSpark)，电子天平，3-18K高速冷冻离心机(德国Sigma)，电泳槽和转膜仪(美国Bio-Rad)，化学发光成像系统(美国Chemi-Doc)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药方法

60只C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组(Con组，n=15)、DM模型组(DM组，n=15)、TLS对照组(TLS组，n=15)和TLS治疗组(DM+TLS组，n=15)。DM组和DM+TLS组连续5d腹腔注射由柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.4)配制而成的0.5% STZ溶液(50mg/kg)，分别在STZ注射后3d和7d进行尾静脉血糖测定，分别测得血糖值≥16.7mmol/L则视为DM小鼠造模成功。而Con组和TLS组用相同方法给予等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。Con组和DM组进行接连2d等量生理盐水腹腔注射，间隔4周。而TLS组和DM+TLS组进行连续2d TLS[1mg/(g·d)]腹腔注射，间隔4周，同时再采用饮水给药2%TLS，共饲养24周[7]。

1.2.2 Western blotting法检测蛋白

取小鼠胰腺组织，裂解液充分裂解后，离心取上清液测定蛋白浓度，电泳转膜及封闭后根据不同抗体的效价，置于一抗4℃孵育过夜，二抗室温1h孵育后用化学发光仪进行底物显色，应用image lab软件进行灰度值分析。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 各组小鼠胰腺组织凋亡蛋白表达情况

DM组Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表达水平相比Con组明显升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白相对表达率明显降低(P<0.05)；DM+TLS组Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表达水平与DM组相比显著降低(P<0.05)；TLS组凋亡蛋白相比Con组无明显差异(P>0.05)，见图1。

与Con组比较，*P<0.05；与DM组比较，#P<0.05

2.2 各组小鼠胰腺组织焦亡蛋白表达情况

DM组NALP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白表达水平与Con组相比显著升高(P<0.05)；DM+TLS组显著逆转了上述改变(P<0.05)；TLS组焦亡蛋白水平相比Con组差异不明显(P>0.05)，见图2。

与Con组比较，*P<0.05；与DM组比较，#P<0.05

3 讨 论

DM的发生发展均伴随着胰腺功能的进行性减退，高糖状态会造成自噬水平异常，导致胰岛细胞凋亡[8]。胰岛是胰腺的内分泌部分，胰岛素是胰岛β细胞分泌的蛋白类激素。胰岛素的作用是降低血糖，其能否正常发挥功效在DM的发病机制中占有重要的作用。DM的发生可导致胰腺中半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(caspase-3)和焦亡蛋白IL-1β增加，以及β细胞功能障碍引起的胰岛素分泌受损和胰岛素抵抗增加[9]。STZ诱导的DM是以β细胞受损和胰岛素分泌减少为特征，在β细胞功能障碍的起始过程中，细胞炎症小体激活半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1(caspase-1)并促进促炎细胞因子(如IL-1β，IL-6和MCP-1)的表达，这些细胞因子可以进一步诱导局部炎症并阻碍胰岛β细胞的正常功能[10]。有研究报道，炎性体不仅诱导细胞凋亡，还诱导细胞焦亡[11]。因此，抑制细胞凋亡和焦亡可以被认为是治疗DM的潜在策略。

凋亡是基因调控的有序的细胞自发死亡方式，DM中胰岛β细胞的凋亡可能是胰岛素相对缺乏的主要机制。在DM的早期会出现高血糖胰岛素抵抗和胰岛β细胞肥大，随着病情的发展，在T1DM和T2DM中都会出现胰腺功能障碍和胰岛β细胞丢失，胰岛β细胞的凋亡是T1DM发展的最后一步，致使胰岛β细胞大量减少，并导致高血糖症的发作[12]。高血糖症中胰岛细胞数量减小，其功能受损也逐渐加剧，而胰岛细胞凋亡是其数量减小和功能受损加剧的基础。因此，抑制胰岛细胞凋亡来保护胰岛细胞成为防止DM胰腺损伤的关键因素。而细胞凋亡主要由凋亡诱导基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2共同调控，Bax/Bcl-2相对表达失调促使下游 caspase信号通路激活，随即引发凋亡，进而导致细胞功能受损。所以，抑制凋亡诱导基因Bax蛋白和caspase家族蛋白表达，以及促进凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表达可为防治DM胰腺损伤发挥重要作用。本实验结果表明糖尿病胰腺中凋亡蛋白Cleaved-Caspase3表达水平明显升高，Bax/Bcl-2比例显著升高，验证高糖提升凋亡水平，而TLS治疗可逆转这一现象，说明TLS可以通过抑制凋亡对DM胰腺发挥保护作用。

细胞凋亡是生理性的死亡方式，而细胞焦亡有别于凋亡但在特征上又具有一定相似性，细胞焦亡是新型促炎的细胞程序性死亡方式。焦亡反应中Caspase-1可被上游炎性小体激活，并参与pro-IL-18/1β的活化和成熟，导致炎症并诱导焦亡细胞膜孔形成，最终导致细胞死亡。进一步研究表明，DM和肥胖会加重胰腺炎的发展[13]，而胰腺炎与炎症因子NALP3、TNF-α、IL-1β、IL-18等有关。NALP3炎性小体，通过与凋亡相关斑点样蛋白(ASC)相互作用来引发炎性小体的形成，ASC会募集并激活pro-caspase-1以产生活性的caspase-1，使pro-IL-1β/18分别转化为成熟和具有生物活性的IL-1β/18，活性IL-1β/18将触发一系列非细菌性炎症反应和细胞焦亡[14]。本实验结果表明，TLS治疗可以有效降低DM小鼠胰腺中NALP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表达，以改善焦亡水平，说明TLS还可以通过抑制焦亡对DM胰腺发挥保护作用。

综上所述，DM可导致小鼠胰腺引发焦亡及凋亡水平增加，进而加重胰腺损伤。TLS可降低DM导致的胰腺组织焦亡水平，减少凋亡细胞的生成，为TLS在DM胰腺组织中产生保护作用提供新的研究视野及理论基础。