结肠癌组织及血清中IL-8、VEGF和MMP-7的表达及其与肿瘤分期的相关性

蓝宇萍，何圣清，陈利芬，曾兰芳

(深圳市龙岗中心医院体检科，广东 深圳 518116)

结肠癌是人类常见恶性肿瘤之一，随着我国居民饮食结构变化，其发病率呈明显上升趋势，严重影响国民生命建康[1-2]。结肠癌临床早期症状较为隐匿，患者多表现为消化不良、腹胀、腹痛等消化道症状，中晚期则有疼痛难忍、便血或腹腔积液等症状，生活质量严重下降，预后不佳[3]。因此，早发现、早治疗对结肠癌预后，提高生存率，延长生存周期具有重要意义。结肠癌病变分为多个阶段，如良性腺瘤向恶性腺癌转变、肿瘤向远处转移等过程[4-5]。研究证实，在结肠癌病变、癌细胞侵袭及转移等进展过程中，肿瘤相关的细胞因子水平变化对疾病分期诊疗具有重要指导意义[6-7]。有报道指出[8-9]，肿瘤组织中白细胞介素8(interleukin-8，IL-8)、VEGF和MMP-7等物质参与调控了肿瘤细胞免疫应答、组织血管新生、内皮细胞的增殖等过程，促进了肿瘤的生长、侵袭和转移，导致癌变恶化，常作为肿瘤疾病的辅助诊疗标志物。本课题组前期研究报道[10]结肠癌患者外周血中IL-8和VEGF的变化，但癌变组织中IL-8、VEGF和MMP-7水平与结肠癌肿瘤分期有何关系尚未深入研究。我们检测了结肠癌组织及外周血IL-8、VEGF和MMP-7水平，探索其与肿瘤分期的相关性，为结肠癌临床诊疗提供一定指导。

1 资料与方法

1.1 纳入及排除标准

纳入标准[10-11]：①经病理级内镜检查确诊为结肠癌患者；②行结肠癌手术切除治疗者。排除标准：①合并其它消化道疾病者；②合并先天性心脏病等严重疾病及肝、肾功能不全者；③有精神系统疾病及无法配合者。

1.2 一般资料

选取我院2013年6月至2015年6月收治的90例结肠癌患者设为观察组，其中男49例，女41例；年龄43～69岁，平均(52.38±4.76)岁；体重52～77kg，平均(64.33±5.46)kg；根据Dukes分期分为A、B、C、D四期[8-9]，A期患者20例，B期患者32例，C期23例，D期15例。选择同期在本院进行健康体检的30例健康者作为对照组，其中男15例，女15例；年龄42～71岁，平均(53.82±4.51)岁；体重53～76kg，平均(66.02±5.28)kg。两组研究对象性别比例、年龄及体重等一般资料差异无统计学意义，具有可比性(P>0.05)。本研究经过医学伦理委员会批准，且患者及家属签署知情同意书后展开。

1.3 检测观察指标

(1)ELISA检测外周血清IL-8、VGEF、MMP-7水平。手术前1d，空腹采集患者静脉血(4mL)，3 000转离心10min取上层血清，分装后冻存于-20℃备用。采用双抗体夹心法测定血清IL-8(购自北京邦定泰克生物技术有限公司)、VEGF(购自上海研辉生物技术有限公司)和MMP-7水平(购自上海研辉生物技术有限公司)

(2)免疫组化SP法测定肠癌组织和癌旁正常组织IL-8、VGEF、MMP-7。取患者结肠癌变组织及癌旁>5cm处正常组织进行病理组织检测。石蜡包埋后切片(4μm)、脱蜡、酒精梯度脱洗，PBS冲洗后再抗原修复。室温避光条件下，滴加过氧化氢溶后再血清封闭孵育20min；然后弃去血清，分别滴加IL-8、VGEF、MMP-7一抗，冰箱4℃孵育过夜；次日，PBS冲洗3次后滴加二抗孵育1h。最后，PBS再次洗涤3次，分别DAB显色、苏木素复染，中性树胶封固，于恒温显色封片光学显微镜进行观察。

(3)IL-8、VGEF、MMP-7的阳性表达评估。免疫组化染色后，细胞质中出现棕黄色颗粒即为阳性。阳性细胞数评分：<5%(0分)、5%～25%(1分)、25%～50%(2分)、50%～75%(3分)、>75%(4分)；染色强度评分：无色(0分)、浅棕黄色(1分)、棕黄色(2分)、褐棕色(3分)。根据两者评分乘积评估：0～4分为阴性，5～12分为阳性。每张切片随机选取10个高倍视野(200倍或400倍)，计算IL-8、VGEF、MMP-7阳性表达情况。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 患者血清IL-8、VEGF及MMP-7水平比较

观察组血清IL-8、VEGF及MMP-7均显著高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组血清IL-8、VEGF及MMP-7水平比较

2.2 不同Dukes分期结肠癌患者血清IL-8、VEGF及MMP-7水平比较

如表2所示，结肠癌患者血清IL-8、VEGF及MMP-7水平随Dukes分期加重逐渐升高。C期、D期患者的血清IL-8、VEGF及MMP-7水平显著高于A期及B期患者，组间两两比较均有统计学差异(P<0.05)。见表2。

表2 不同Dukes分期结肠癌患者血清IL-8、VEGF及MMP-7水平比较

2.3 结肠癌组织IL-8、VEGF及MMP-7阳性表达结果比较

结肠癌组织IL-8、VEGF及MMP-7免疫组化结果如图1～3(封三)所示，可见明显棕黄色阳性表达。统计分析显示，结肠癌组织中IL-8、VEGF及MMP-7阳性表达率分别为86.67%，92.22%及82.22%，显著高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 结肠癌组织及癌旁正常组织IL-8、VEGF及MMP-7阳性表达比较

2.4 结肠癌组织IL-8、VEGF及MMP-7与Dukes分期的相关性

结肠癌A期患者中IL-8、VEGF及MMP-7阳性发表率分别为80.00%、90.00%、80.00%，B期患者分别为84.34%、87.50%、81.25%，C期患者分别为95.65%、100.00%、86.96%，D期患者分别为86.67%、93.33%、80.00%。见表4。

表4 结肠癌组织IL-8、VEGF及MMP-7与临床Dukes分期相关性

2.5 患者结肠癌组织、血清IL-8与VEGF、MMP-7的相关性

Pearson相关性分析发现，患者血清IL-8与VEGF、MMP-7显著正相关(r=0.880，P<0.05；r=0.774，P<0.05)；结肠癌组织中IL-8也与VEGF、MMP-7显著正相关(r=0.622，P<0.05；r=0.473，P<0.05)。

3 讨 论

随着我国居民饮食结构变化，结肠癌发病率呈上升趋势，严重威胁国民生命建康[1-2]。临床上治疗多采取肿瘤切除术，大量临床实践表明早发现、早治疗是提高患者预后的有效方法，且结肠癌细胞的增殖、扩散和转移是影响结肠癌治疗和预后的重要因素，也是促使肿瘤患者死亡的重要原因[4-5]。因此，密切关注结肠癌肿瘤转移一直是临床研究的热点。目前，临床结直肠癌患者的预后主要通过Dukes分期进行评估，需要更简单有效的生物标志物预测患者肿瘤转移，实时监测肿瘤组织转移对临床预后判断及指导治疗有非常重要的意义。

关于肿瘤组织转移的机制尚未明确阐述，目前多被认为是由肿瘤组织上皮细胞过度增生，同时从原发部位脱落及转移，获得生长所需营养物质后诱发肿瘤组织新生血管生成，进而促进肿瘤组织增殖及分化，完成肿瘤组织转移[12-13]。该过程中肿瘤组织内新生血管的生成与肿瘤侵袭和转移密切相关，为肿瘤的生长繁殖提供营养物质及血氧需求，两者相辅相成加速肿瘤细胞的增殖和扩散[14]。肿瘤的生长及转移依赖于新生肿瘤血管，为肿瘤组织生长提供所需的血氧及营养物质。IL-8作为CXC基因家族因子，广泛存在于肿瘤组织中。本文结果显示，结肠癌患者组织中IL-8阳性率显著高于癌旁正常组织，且在血清IL-8也有较高表达(P<0.05)；随着Dukes分期加重，结肠癌组织和血清中IL-8表达也逐渐上调(P<0.05)，这表明IL-8大量释放，参与了结肠癌的发生发展。

IL-8以旁分泌方式与白细胞和血管内皮细胞表达的CXCR受体结合，促使白细胞趋化进入肿瘤组织和引起内皮细胞增殖形成新生血管，促进肿瘤组织转移[15-16]。VEGF和MMP-7被认为与调节血管内皮细胞增殖和分裂相关，提高肿瘤生长速率及侵袭和转移潜力，可作为判断结肠癌恶性程度的标志物。观察组患者结肠癌组织中VEGF及MMP-7阳性表达率较癌旁正常组织有明显升高(P<0.05)，同时血清中VEGF及MMP-7变化和组织中具有一致性。作为促血管生成因子，VEGF可加速内皮细胞的增殖与分裂，增强毛细血管上皮细胞的通透性，促进肿瘤组织内新生血管的形成[17-18]；而MMP-7则能降解和破坏靠近肿瘤表面的细胞外基质和基膜，加速肿瘤细胞向周围组织的浸润[19-20]，VEGF和MMP-7协调加速了肿瘤细胞增殖及转移能力。因此，患者结肠癌组织和血清中VEGF及MMP-7表达越高，Dukes分期就越严重。

随肿瘤侵袭转移，患者结肠癌组织及血清中IL-8表达上调的同时，VEGF、MMP-7含量也明显增加，Pearson相关性分析显示IL-8水平与VEGF、MMP-7含量显著正相关(P<0.001)，IL-8可作为辅助临床诊疗的重要评估指标之一。IL-8在结肠癌中通过哪一条信号通路，直接或间接激活VEGF、MMP-7上调促进肿瘤进展尚未完全明确，具体机制有待后续动物或细胞实验证实。

综上所述，IL-8、VEGF及MMP-7在结肠癌组织和血清中均有高表达，与肿瘤Dukes分期密切相关；同时结肠癌组织及血清中IL-8表达与VEGF及MMP-7明显正相关，在结肠癌发生发展过程中起到重要作用。IL-8、VEGF及MMP-7可作为临床诊疗及预后的重要评估指标，辅助指导临床治疗。