替米沙坦对高血压大鼠心肌纤维化的抑制作用*

周慧芬，李 勇，孔维浩，赵辛元

(1.湖北科技学院基础医学院，湖北 咸宁 437100；2.咸宁市卫生服务中心；3.湖北科技学院临床医学院)

高血压是临床常见的慢性病，是心脑血管病最主要的危险因素，严重危害人民的健康。长期的压力负荷可通过心脏、血管结构和功能的改变，引起左心室心肌重塑和心室纤维化，包括心肌细胞肥大、凋亡和胚胎基因、蛋白质的再表达[1]。其中，心室重塑是指心室几何、质量、体积和功能的变化，以适应心肌损伤或负荷的变化，病理性心室重塑程度是预测心脏病预后的有力证据[2]；心肌纤维化是指心肌间质胶原浓度升高及胶原特性构型改变[3]，它是高血压后期心肌重塑的关键病理特征之一，也作为高血压病程中出现心肌缺血、心律失常甚至心源性猝死的重要原因[4]。血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(ARB)可减少心血管疾病(CVD)事件[5]。ARB替米沙坦通过血管紧张素Ⅱ AT1受体阻滞和过氧化物酶体增殖物激活的受体γ(PPARγ)激活来减轻炎症[6]，而炎症是高血压进程中心肌纤维化重要表现。本研究通过建立高血压的大鼠模型，探讨替米沙坦治疗对心肌纤维化的抑制作用及可能机制，为临床早期干预并治疗心肌纤维化提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

12周龄雄性SD大鼠28只，体重(220±20)g，由武汉大学ABSL-3实验动物中心提供，分笼(4只/笼)饲养于标准动物房(23℃)，常规饲料喂养，自由饮食饮水，以及规律光照(昼夜各12h)。替米沙坦试剂购于上海勃林格殷格翰药业有限公司(80mg)。MMP-1、TIMP-1单克隆抗体，胶原Ⅰ、胶原Ⅲ单克隆抗体，SP试剂盒，DAB显色试剂购于武汉博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 高血压模型的建立及分组

大鼠随机分为空白对照组(n=7)、假手术组(n=7)及模型组(n=14)。模型组采取二肾一夹法[5]建立高血压大鼠模型，建模成功的大鼠随机分为模型组、替米沙坦治疗组(以下简称治疗组)，每组各7只。治疗组给予替米沙坦(30mg/kg)灌胃，其它3组给予同体积的生理盐水灌胃，1次/d，每周测量一次血压，连续8周。

1.2.2 组织称重并取材

禁食12h，每只动物称取体重(BW)后，乙醚麻醉，解剖后迅速取出心脏，称心脏(HW)和左心室(含室间隔)重量(LVW)，心脏体重指数为HW/BW(mg/g)，左心室体重指数为LVW/BW(mg/g)；取适当大小的左室心肌组织迅速投入10%甲醛固定。

1.2.3 心肌组织染色并观察

取10%甲醛固定好的左室游离壁处心肌组织常规HE染色，光镜下观察心肌细胞及心肌间质的变化。使用免疫组织化学SP法染色[5]，检测心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达及基质金属蛋白酶1(MMP-1)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)的表达，用已知的阳性切片同一条件下染色作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照显微镜观察，胞浆呈棕黄色颗粒表明免疫组化阳性，每张切片随机选取5个视野，Olympus BX50显微镜摄像系统摄像，采用高清晰彩色图文报告分析系统分析，以5个视野的光密度(OD)的平均值作为各标本的蛋白表达水平。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 替米沙坦对高血压大鼠血压、HW/BW、LVW/BW的影响

实验结果显示：与空白对照组相比，假手术组血压值、HW/BW、LVW/BW变化不明显(P>0.05)，其它两组数据明显升高(P<0.05)；与模型组相比，治疗组的血压、HW/BW、LVW/BW则明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 大鼠收缩压、HW/BW、LVW/BW的改变

2.2 替米沙坦对大鼠心肌心肌纤维化的影响

实验结果显示：心肌组织通过HE染色并在光学显微镜下观察(图1，封二)，空白对照组或假手术组心肌组织结构正常，无明显间质纤维增生，而模型组、治疗组心肌组织结构较凌乱，间质纤维增生明显，但治疗组心肌间质纤维增生较模型组显著减轻。

2.3 替米沙坦对大鼠心肌组织Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原表达的影响

通过免疫组织化学染色对心肌组织Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原表达的检测(图2，封二)，在光学显微镜下观察，空白对照组、假手术组心肌组织的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原阳性表达不明显，而模型组的阳性表达显著，但经替米沙坦治疗后其表达又明显减弱；通过OD值比较(表2)，模型组、治疗组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达的OD值明显高于空白对照组或假手术组(P<0.05)，而治疗组又显著低于模型组(P<0.05)。

表2 实验大鼠心肌组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-1及TIMP-1的OD值

2.4 替米沙坦对大鼠心肌组织MMP-1及TIMP-1表达的影响

结果显示：通过免疫组织化学染色对心肌组织MMP-1及TIMP-1表达的检测(图3，封二)，在光学显微镜下观察，模型组心肌组织的MMP-1的阳性表达明显弱于空白对照组或假手术组，而治疗组的阳性表达较其他组明显增强；模型组心肌组织的TIMP-1的阳性表达明显强于空白对照组或假手术组，而治疗组的阳性表达较模型组明显减弱。

通过OD值比较(表2)，模型组心肌组织MMP-1表达的OD值明显低于空白对照组或假手术组(P<0.05)，治疗组则明显高于其他组(P<0.05)；模型组心肌组织TIMP-1表达的OD值明显高于空白对照组或假手术组，而治疗组则明显低于模型组(P<0.05)。

3 讨 论

本研究通过结扎肾动脉造成肾动脉狭窄，以建立高血压大鼠模型，术后2周收缩压开始上升，4周稳定，参考文献标准[7]，当收缩压持续超过160mmHg，且上升值大于30mmHg时，模型建立成功。

据文献[8]报道，作为高血压并发症严重程度的敏感指标，左心室肥厚(LVH)是老年高血压患者心血管事件的独立危险因素；本研究实验结果显示，模型组的HW/BW、LVW/BW均明显高于空白对照组或假手术组，提示高血压引起大鼠左室明显肥厚。另有文献报道[9]，随着高血压LVH程度的进行性加重，心肌间质胶原纤维蛋白显著增多。胶原蛋白为心肌间质基质的主要成分，由Ⅰ型和Ⅲ型胶原构成，其中80%以上为Ⅰ型，Ⅲ型仅占11%左右，此外还有少量Ⅳ型及V型胶原等[10-11]。本研究结果显示模型组大鼠的心肌组织结构较凌乱，有明显的局部纤维化，而且其Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达均明显高于空白对照组及假手术组，提示高血压引起了心肌纤维化。此外，心肌纤维化是心肌重构的关键，近年研究发现[12]，基质金属蛋白酶(MMPs)在心肌组织中的大量表达，能特异性地降解细胞外基质(ECM)，同时组织抑制剂(TIMPs)及一些细胞因子调控MMPs的产生，所以MMPs/TIMPs的比例失调是导致心肌纤维化的重要因素。本研究同样显示，模型组相对于空白对照组或假手术组，其心肌组织的MMP-1表达上升，而TIMP-1表达则显著下降(P均<0.05)，说明它们在高血压引起的心肌纤维化过程中起重要的调节作用。

替米沙坦是非肽类血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，通过阻滞特异性血管紧张素受体，干扰RAAS的活性，降低人体血压[13]，目前已有文章[14]报道，血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(ARB)能有效降低血压，作为一种新型的降血压药物用于轻到中度的高血压治疗[15]，但对于ARB逆转高血压心脏重构，减少或防止MF的发生，尚存较多问题：①心肌纤维化的发生机制目前还未完全阐明，故缺乏特异的治疗药物针对心肌纤维化；②国外有报道在高血压早期就发现有心肌纤维化的组织学证据[16]，故早期干预心肌纤维化具有重大意义，但是否能让患者受益更多还需要进一步的研究；③现今大部分的药物研究还停留在动物实验和小样本临床试验的阶段，仍需要大规模多中心临床试验进一步验证。在研究中，替米沙坦治疗组相对于模型组，其收缩压、HW/BW及LVW/BW显著降低，心肌间质Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达水平明显下调，且心肌组织MMP-1水平升高而TIMP-1水平降低，说明替米沙坦可能通过MMPs/TIMPs机制抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的生成，从而减轻心肌间质纤维化及左心室肥厚。本研究结果可以为临床早期干预或治疗高血压性心肌纤维化提供一定的实验依据。