复合益生菌制剂对人体肠道菌群组成的调节作用

毛丙永，崔树茂*，潘明罗，黄洁，王健，吴晚生，郭仁妹，赵建新

（1.江南大学食品学院，江苏无锡 214122）（2.苏州硒泰克生物科技有限公司，江苏苏州 215000）

人体肠道内寄居着大量的微生物，种类超过1000种[1]。越来越多的证据表明，肠道菌群在人体健康许 多方面起了关键作用，包括免疫、代谢和神经行为特征[2]。肠道细菌可以发酵一些不可消化的底物，产生短链脂肪酸，并产生多种气体，包括氢气、硫化氢、二氧化碳、甲烷等，其中氢气在胃肠道菌群能量代谢中具有能量转化作用。许多对人类营养、疾病和健康密切相关的细菌的代谢通路均涉及到氢气[3]。

肠道菌群组成处于一个不断变化的动态平衡中，人体基因、饮食、环境及抗生素使用等，均会对肠道菌群组成产生一定程度上的影响。当饮食结构发生改变时，肠道菌群也会快速响应发生变化[4]，如食用抗性淀粉在某些人中可以提高青春双歧杆菌、直肠真细菌等的丰度[5]。肠道菌群组成的改变与一些疾病的发生密切相关。如一些肠道细菌可以代谢膳食中的胆碱产生三甲胺，在肝脏内被转化成氧化三甲胺，与患动脉粥样硬化的风险增加呈正相关[6]；Baothman等[7]研究发现肠道菌群在肥胖的发生和发展过程中起重要作用，肠道菌群失调可能通过多种机制促进饮食诱发的肥胖和代谢并发症。

益生元一般指不能被人体所消化吸收但可被人体微生物选择性利用，能够改善肠道微生物组成和活性从而益于人体健康的食物成分[8]，促进肠道内有益菌的增殖，从而调节肠道菌群。益生菌是一类活的微生物，当摄入足够量时，会对宿主健康产生有益作用[9]。目前，益生菌主要是一些双歧杆菌和乳杆菌，可以存在于固体饮料、发酵乳制品、膳食补充剂或药物等多种产品中。一方面，益生菌能够在肠道内稳定定殖，调节肠道菌群组成[10]；另一方面，益生菌通过发酵未被消化的碳水化合物产生短链脂肪酸，为肠上皮细胞提供能量，进而影响肠上皮屏障和调节天然免疫细胞及T细胞、B细胞介导的特异性免疫。

目前，针对一些肠道菌群紊乱相关的疾病治疗中，通常会采用多种益生菌进行组合，或者结合益生菌和益生元进行干预，以提高干预效果。本实验拟开展一种复合益生菌制剂的人群干预研究，通过高通量测序技术分析干预前后志愿者的肠道菌群组成，评价该复合益生菌制剂的干预效果，为益生菌制剂的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

复合益生菌制剂，包括低聚果糖（40%）、菊粉（50%）、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌，其总活菌数为100亿CFU/袋，购自苏州硒泰克生物科技有限公司；细菌基因组提取试剂盒Fast DNA Spin Kit for feces，购自美国MP Biomedicals公司；2×Taq master mix预混液，购自江苏康为世纪生物科技有限公司；引物（341F和806R）、琼脂糖，购自生工生物工程（上海）有限公司；胶回收试剂盒，购自杭州倍沃医学科技有限公司；Qubit dsDNA BR reagent染料，美国Life Invitrogen公司；TruSeq DNA HT Sample Preparation Kit、KAPA biosystems library quantification Kit试剂盒、上机测序试剂盒MiSeq Reagent Kit v3，购自美国Illumina公司。

1.2 仪器与设备

快速核酸提取仪FastPrep-24，美国MP公司；超低温冰箱，美国Thermo Scientific公司；冷冻离心机，德国Eppendorf公司；PCR仪、凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司；UV-2000切胶仪，上海天能科技有限公司；Qubit 3.0荧光定量仪，美国Life Invitrogen公司；MiSeq测序仪，美国Illumina公司；Agilent Bioanalyzer 2100，美国安捷伦公司。

1.3 实验方法

1.3.1 志愿者招募及干预

本实验共招募15名志愿者（7名男性，8名女性），年龄在50～70岁之间（平均年龄为61.5岁）。每天采用温水服用1袋复合益生菌制剂（3 g/袋），连续服用28 d，服用前与连续服用28 d后分别收集粪便，储藏于-80 ℃，备用。

1.3.2 细菌基因组的提取

参照Hanskia等[11]的方法，按照Fast DNA Spin Kit for feces试剂盒的说明书提取粪便样品中的细菌基因组，并保存于-80 ℃冰箱备用。

1.3.3 细菌16S rDNA的V3-V4区的PCR扩增

以提取的细菌基因组为模板，采用引物（341F：CCTAYGGGRBGCASCAG，806R：GGACTACNNGG GTATCTAAT），扩增16S rDNA的V3-V4区，片段大小为466 bp。不同样品用7个碱基组成的barcode（5’-端）进行区分，反应体系为（50 μL）：模板1 μL，上游引物341F：0.5 μL，下游引物806R：0.5 μL，2×Taq PCR Mix预混液25 μL，双蒸水23 μL。

PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s→52 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min，12 ℃ 10 min。PCR反应结束后，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，电压120 V，时间60 min。电泳结束后，进行胶回收与定量。

1.3.4 V3-V4区PCR产物的胶回收与定量

经琼脂糖凝胶电泳获得带目的条带的胶体，利用切胶仪将目的片段（466 bp）切下，按照胶回收试剂盒的说明书回收PCR产物。PCR产物回收后，保存于-20 ℃冰箱备用。

纯化后的DNA，按照Qubit 3.0荧光定量仪的说明书测定其浓度（ng/μL）。

1.3.5 文库构建与上机测序

根据DNA浓度的定量结果，按等质量浓度混合样品，总体积为50 μL，样品总量为200 ng，样品数量＜50。按照TurSeq DNA HT Sample Preparation Kit试剂盒说明书构建文库，主要包括末端修复、3’端加A、接头连接以及PCR扩增等步骤。

文库构建后，采用Agilent Bioanalyzer 2100生物分析仪测定DNA片段大小，然后利用KAPA biosystems library quantification kit试剂盒说明书精确测定DNA的浓度，然后将构建好的文库经过稀释、变性，最后加入已融化的上机试剂盒MiSeq Reagent Kit v3，MiSeq测序仪上机测序。

1.3.6 生物信息学分析

测序完成后，使用简单的unix命令按照barcode序列将下机数据拆分成单个样品的fastq文件，利用cutadapt软件去除V3-V4区域扩增的引物，Qiime2-DADA2包对测序数据进行预处理，包括过滤有噪声的序列、矫正错误序列、去除嵌合体序列以及去除出现一次的低频序列，最后合并降噪后的双端序列。DADA2对去噪的序列直接去冗余形成相似度为100%的features。通过Ribosomal Database Project (RDP) Naive Bayes classifier[12]鉴定OTU种系型。

利用greengenes数据库与序列进行比对，采用FastTree构建系统进化树，确定肠道菌群物种。绘制稀释曲线，计算样品的α-多样性和β-多样性；采用主坐标分析（Pricipal Coordinates Analysis，PCoA）可以直观反映肠道微生物群落整体差异，样本组成越相似，其在PCA图上的距离越近[13]；肠道菌群特定差异菌属利用线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）效应大小（effect size，LEfSe）进行分析探究。

2 结果与分析

2.1 稀释曲线

图1 稀释曲线Fig.1 The rarefaction curve

本实验共收集30份粪便样品，其中复合益生菌制剂干预前样品15份，干预后样品15份。通过MiSeq高通量测序，30个样品共产生623,655条高质量的16S rDNA的V3-V4区序列，平均每个样品20,788条，共产生733个features，由测序深度与观测到的物种数量制作的稀释曲线如图1所示。在本实验当前测序量下，样品的稀释曲线进入平台期，表明测序深度已经能够满足本实验菌群分析的目的。

2.2 粪便菌群的α多样性分析和PCoA分析

图2所示为粪便菌群的α多样性分析，包括Shannon指数和Evenness指数，并用Anova检验方法进行差异显著性检验。由Shannon指数箱线图（图2a）可知，复合益生菌制剂干预前后，肠道菌群的Shannon指数未发生显著改变（p=0.47），这说明干预前后肠道微生物的多样性无发生显著性的差异；由Eveness指数图可知，复合益生菌制剂干预前后样品的均匀度也未发生显著改变（p=0.48），进一步说明复合益生菌制剂对个体的均匀程度影响较小。

图2 样品的α多样性-Shannon指数箱线图（a）和Eveness指数箱线图（b）Fig.2 Theα-diversity of samples including Shannon index (a) and Eveness index (b)

基于加权UniFrac距离、未加权UniFrac距离和Bray算法对所有样品的菌群数据进行PCoA分析，发现复合益生菌制剂干预前，15名志愿者的样品在PCoA图中分布较为离散。在3种不同算法下得到一致的结果，表明肠道菌群存在明显的个体差异性。复合益生菌制剂干预后，15名志愿者的样品在PCoA图中分布较为聚集，并未明显分开，这可能是由于干预时间比较短导致的。

图3 基于加权UniFrac的PCoA主坐标分析图（a）、未加权UniFrac的PCoA主坐标分析图（b）和基于Bray算法（c）的PCoA主坐标分析图Fig.3 The PCoA analysis based on the weighted UniFrac distance (a), the PCoA analysis based on unweighted UniFrac distance (b) and the PCoA analysis based on Bray distance (c)

2.3 复合益生菌制剂干预对肠道菌群组成的影响

在门水平上，志愿者粪便样品中共检测到7个门，包括放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、柔壁菌门（Tenericutes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）（图4）。复合益生菌制剂干预前，志愿者的肠道菌群中相对丰度最大的是厚壁菌门（68.5%），其次是放线菌门（15.2%），变形菌门（10.6%）和拟杆菌门（5.5%）。复合益生菌制剂干预后，粪便样品中厚壁菌门和放线菌门的相对丰度增加，但无统计学显著性，这可能与制剂中主要包括乳杆菌和双歧杆菌有关，乳杆菌属于厚壁菌门，而双歧杆菌属于放线菌门。此外复合益生元制剂中含有菊粉和低聚果糖能有效提高放线菌门的丰富度[14]。而复合益生菌制剂干预后，粪便中拟杆菌门和变形菌门的相对丰度减少，但无显著性差异。先前研究表明一型糖尿病患者中拟杆菌门的丰富度明显增加，这会影响宿主TLR2/TLR4基因的表达[15]。因此，降低拟杆菌门有利于改善宿主健康。

图4 复合益生菌制剂干预前后肠道菌群组成的变化（门水平）Fig.4 Changes in the composition of intestinal microbiota at the phylum level before and after compound probiotics intervention

图5 复合益生菌制剂干预前后肠道菌群组成的变化（属水平）Fig.5 Changes in the composition of intestinal microbiota at the genus level before and after compound probiotics intervention

在属水平上，粪便样品中共检测到143个属，其中相对丰度在前25位的属的变化如图5所示，其中20个属的相对丰度在1%以上。复合益生菌制剂干预前，志愿者粪便菌群中相对丰度最大的属为布劳特氏菌属（Blautia，17.0%），这是一个较为新兴的物种分类，广泛存在于哺乳动物的粪便和肠道中，其丰度与慢性疾病包括炎症性肠病、结肠癌、肥胖、糖尿病等密切相关[16-19]，其次为双歧杆菌属（Bifidobacterium，12.7%），链球菌属（Streptococcus）、埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella，7.3%）、罗姆布茨菌(Romboutsia，5.0%）、拟杆菌属（Bacteroides，4.2%）、霍氏真杆菌属(Eubacteriumhalliigroup，3.5%）和乳杆菌属（Lactobacillus，3.5%）也具有较高的相对丰度。复合益生菌制剂干预后，布劳特氏菌属的相对丰度降低（由17.0%降至16.3%），12个属的相对丰度增加，包括霍氏真杆菌属、棒状菌属（Anaerostipes）、柯林斯菌属（Collinsella）、多尔氏菌属（Dorea）、丹毒丝菌属（Erysipelotrichaceae UCG-003）、真细菌属（Eubacterium）、柔嫩梭菌属（Faecalibacterium）、纺锤链杆属（Fusicatenibacter）、乳杆菌属、瘤胃球菌属和链球菌属。乳杆菌属相对丰度的增加，对宿主健康会产生有益的影响；柔嫩梭菌属相对丰度的增加能提高肠道内丁酸含量，改善肠道炎症[20]。然而，这些属相对丰度的增加并不显著。

图6 复合益生菌制剂干预前后肠道菌群发生显著变化的种属分析-LEfSe分析Fig.6 Linear discriminant analysis effect size (LEfSe) analysis of the different intestinal microbiota before and after compound probiotics intervention

由LEfSe分析（图6）可知，复合益生菌制剂干预后，Chloroplast（目）、Cyanobacteria（门）和Oxyphotobacteria（纲）的相对丰度显著高于干预前，而Dialister（属）、Veillonellaceae（科）、Selenomonadales（目）和Negativicutes（纲）的相对丰度显著低于干预前。先前研究发现，Cyanobacteria在高脂饮食小鼠中具有较低丰富度，因此，高丰富度Cyanobacteria可能会增加患高血脂症的风险[21]。

2.4 复合益生菌制剂干预对肠道内产氢气细菌相对丰度的影响

图7 复合益生菌制剂干预前后肠道内主要产氢气属的相对丰度变化Fig.7 Changes in the relative abundance of the hydrogen-producing bacteria in the intestinal tract before and after compound probiotics intervention

除双歧杆菌属和乳杆菌属外，肠道内还有一些产氢气的细菌对宿主健康具有重要的影响。根据Wolf等人[22]的研究，并结合《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》（《伯杰氏系统细菌学手册》）[23,24]，分析了肠道内主要产氢气细菌的相对丰度的变化，主要包括柯林斯菌属（Collinsella）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、多尔氏菌属、罗斯氏菌属（Roseburia）、韦荣球菌属（Veillonella）、斯莱克氏菌属（Slackia）和真细菌属（Eubacterium）等8个属。复合益生菌制剂干预后，粪便样品中双歧杆菌属、乳杆菌属、柯林斯菌属、瘤胃球菌属、多尔氏菌属和真细菌属的相对丰度增加，但增加不显著。然而，梭状芽孢杆菌属、罗斯氏菌属、韦荣球菌属和斯莱克氏菌属的相对丰度减少，但无统计学显著性。

以上结果表明，复合益生菌制剂干预会改变肠道菌群组成，其中双歧杆菌属、乳杆菌属、柯林斯菌属、瘤胃球菌属、多尔氏菌属Dorea和真细菌属相对丰度增加，但存在个体差异。

3 结论

本文通过分析15名志愿者在服用复合益生菌制剂前后的肠道结构的变化，探索复合益生菌制剂对肠道菌群结果的影响。服用复合益生菌制剂能改变肠道内一些微生物的丰富度，对肠道内一些产氢气细菌的丰度产生影响，但无统计学显著性，这可能与其干预时间有关系。且由于个体肠道菌群差异以及一些不可控因素的存在，人群干预实验的检测指标通常具有较大的离散性、差异较大，但积极开展人群干预实验对于产品开发与评价，具有非常重要的指导意义。