乙醇胁迫提高植物乳杆菌p-8的共轭亚油酸(CLA) 转化率和相关酶转录水平

秦雅丽，赵国芬*，王丹，张和平，赵微

（1.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010000）（2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特 010000）（3.山西师范大学食品科学学院，山西临汾 041004）

共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是含有共轭双键的十八碳二烯酸的总称，是亚油酸的几何异构体，并由亚油酸（Linoleic acid，LA）衍生而来，其中c9,t11-CLA和t10,c12-CLA是最主要的同分异构体[1]。CLA具有多种生理功能，例如抗癌，预防心血管疾病，增强免疫力，抗糖尿病等，对人体健康有积极作用[2,3]，已成为医学、化学、食品科学和营养学等领域的研究热点[4,5]。

天然CLA在很多反刍动物食品中存在，主要是反刍动物肠胃中瘤胃微生物把动物饲料中的亚油酸（Linoleic acid，LA）进行异构化而来的[6]。因此，反刍动物的肉制食品及其乳制食品是摄入CLA的主要来源[7]。而以乳和肉制品为主的德国居民平均每日的摄入量仅为350 mg[8]，这对于专家建议每日CLA摄入量3500 mg是远远不够的，因此向食品中强化CLA含量是一种有效的摄取途径[9]，而CLA的合成通常使用化学合成法和生物合成法来制备[10]。

乳酸菌是生物转化生成CLA的最佳微生物。其在LA转化为CLA的过程中涉及脂肪酸水合酶（Fatty acid hydratase，CLA-HY）、羟基脂肪酸脱氢酶（Hydroxy fatty acid dehydrogenase，CLA-DH）、乙酰乙酸脱羧酶（Acetoacetate decarboxylase，CLA-DC）、烯酮还原酶（Enone reductase，CLA-ER）和烯醇化酶（Enolase，Eno），其中CLA-HY与肌球蛋白交叉反应抗原（Myosin cross reactive antigen，MCRA）的同源性高，所以前期研究中MCRA就是CLA-HY。杨波[11]发现多个乳酸菌属由cla-hy、cla-dh和cla-dc表达亚油酸异构酶的三组分体系，且cla-dh和cla-dc为一个转录单位，cla-hy为另一个转录单位，显然2个转录单位的调控机制是不同的。据报道，降低氧的浓度，添加胆盐、有机溶剂（如吐温-80）、乳酸钠和一些辅助因子，增加细胞膜的通透性和疏水性都可以提高CLA转化率[12,13]，但其调控的分子机制尚不明确。

前期研究表明，L. plantarump-8也产CLA，该菌还有提高奶牛的产奶量、肉鸡的免疫能力，和缓解成年人压力、焦虑等功能[14-16]。基于L. plantarump-8在食品、畜牧业的应用以及其产有益生活性CLA的能力[17]，本文以该菌株为材料，拟进行不同浓度乙醇胁迫下CLA转化及其合成相关酶基因转录水平差异的研究，为揭示乳酸菌产CLA的分子调控机制来提高CLA产量和拓展L. plantarump-8在食品畜牧业的应用空间奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料与试剂

仪器：气相色谱仪，气相色谱仪为岛津GC-2010；qPCR仪，德国耶拿qTOWER2.2；恒温摇床，上海福玛实验设备有限公司；单面净化工作台（W-CJ-2FD），苏州净化公司；超低温冰箱（707 REVCO），美国Thermo公司；高温高压灭菌锅，日本Hirayama公司；高速冷冻离心机，德国EPPENDOF公司；分析天平，上海精密仪器仪表有限公司。

菌株：本实验中所用L. plantarump-8由本实验室保存。

试剂：亚油酸、十七烷酸、DEPC购置于美国Sigma-Aldrich公司；DNA Marker购置于天根生化科技(北京)有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、甲醇、乙醇、正己烷、冰乙酸、异丙醇、丙三醇、葡萄糖、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、吐温80、硫酸镁、硫酸锰购置于国药集团化学试剂有限公司；吐温20、Tris购置于美国AMRESCO公司；细菌RNA提取试剂盒购置于瑞士omega公司；一步式反转录试剂盒购置于TaKara公司。

1.2 方法

1.2.1 LA对L. plantarump-8生长的影响

将亚油酸加入MRS培养基中，至最终浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL，等量无菌蒸馏水作为对照。将植物乳杆菌p-8按照1%的接种量加入，缓慢混匀后37 ℃静置厌氧培养。检测6、12、18、24 h的活菌数量，通过活菌计数法来确定选取LA浓度。

1.2.2 引物设计

在NCBI上查阅L. plantarump-8五种CLA合成相关酶以及16S rRNA的基因序列，利用Primer 5.0设计了6对特异性引物，交付华大基因公司合成。

6对引物序列分别是：

16S rRNA-F：GATAACACCTGGAAACAGATG C，16S rRNA-R：GACCATCCAAAAGTGATAGCC；

cla-hy-F：CAACGATGGGTGATTACAACA，cla-hy-R：CCCTAAGTTATAGAACCGCTCAG；

cla-dh-F：ACTGAAGCGACCGCCTAT，cla-dh-R：GGTTTCCCGTTGGTAATG；

cla-dc-F：GACAACAGTGCGACAGCC，cla-dc-R：TGGTTCGTCCCATCTTCA；

cla-er-F：GGCAAAGGCTAAGTTCAA，cla-er-R：CATAATGCGACTGGGTGT；

cla-eno-F：GCAAAGGGTATCAAGATG，cla-eno- R：TAAGTCAGCAATGGTCGT。

1.2.3L. plantarump-8培养

挑取L. plantarump-8单菌落在MRS液体中连续培养两代后，按1%的接种量（活菌数为1.43×109CFU/mL）接种至21个50 mL MRS液体培养基中，每个瓶添加浓度为0.05 mg/mL的LA，然后分别以0、0.50%、1%、1.50%、2%、2.50%和3%的添加量添加乙醇，每种浓度3瓶，37 ℃静置培养至对数期，无菌操作取出发酵液5 mL，提取RNA，分析不同乙醇胁迫下cla-hy、cla-dh、cla-dc、cla-er和cla-eno的mRNA水平差异。将剩余菌液继续培养3 d后测定脂肪酸，分析不同乙醇胁迫下CLA转化率差异。

1.2.4 CLA的检测

将经LA诱导和乙醇胁迫培养3 d的L. plantarump-85000 r/min离心10 min，分别收集菌体和发酵上清液。用KPB缓冲液悬浮并清洗菌体，超声破碎（条件为：功率400 W；间歇4 s，破碎2 s，共30 min），对破碎液和离心之后的发酵上清液和菌体进行脂肪酸抽提，具体的步骤如下：

（1）发酵液脂肪酸抽提：取4 mL发酵液于洁净的试管中，取已添加十七碳烷酸的异丙醇2 mL，充分混匀1 min后加入4 mL的正已烷，再次混匀1 min，5000×g离心10 min。吸取上层的透明正已烷层，转移到干净试管中，然后用氮气将其吹干。

（2）菌体脂肪酸抽提：菌体离心后使用菌体洗涤液进行洗涤，向10 mL菌液离心后的菌体加入2 mL的菌体洗涤液，充分混匀1 min，5000 ×g离心10 min。重复洗涤两次后将菌体悬于洗涤液中，再按照发酵液的抽提方法进行抽提。

以十七烷酸做内标，使用盐酸-甲醇法对抽提后的脂肪酸进行甲酯化处理，准确吸取1 μL甲酯化样品进样[11]。定量方法为内标法，进行转化率的计算，计算方法如下：

式中：

As——内标物的峰面积；

Ar——对照品的峰面积；

ms——加入内标物的量；

mr——加入对照品的量；

Ai——待测物的峰面积。

色谱操作条件：色谱柱为CP-WAX 52CB。载气流量2 mL/min，分流比15:1分流进样，进样口温度为240 ℃。采用程序升温：120 ℃保温3 min，然后以每分钟升5 ℃至190 ℃，再每分钟升1 ℃至210 ℃，保温3 min，总时间为56 min。

1.2.5 产CLA相关酶转录水平分析

按照omega公司的细菌RNA提取试剂盒提取培养至对数期各菌的RNA。用1.20%的琼脂糖凝胶电泳进行检测后，用TaKara公司反转录试剂盒进行反转录获得cDNA。以cDNA为模板进行qPCR，qPCR反应体系20 μL，包括SYBR Premix Ex Taq13 μL，引物1（10 μmol/L）和引物2（10 μmol/L）各1 μL，模板cDNA 1 μL，dd H2O 7 μL。95 ℃变性30 s后进行30个循环，每个循环95 ℃变性5 s、55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min。然后72 ℃再延伸10 min。每个条件重复三次，记录每个样品Ct值。

RT-qPCR数据分析：以不添加乙醇的菌为对照，其他添加不同乙醇浓度的菌为实验组，各组的16S rRNA为内参基因，根据RT-qPCR所得Ct值，按照2-ΔΔCt法分析对数期不同乙醇浓度下5个基因相较于不添加乙醇的相对表达量。

以添加一定浓度乙醇下对数期的cla-hy基因为例：

式中：

ΔCt0——无乙醇；

ΔCt1——添加一定浓度乙醇。

最后按2-ΔΔCt公式进行计算，即得到对数期的添加一定浓度乙醇的cla-hy基因相比不添加乙醇的cla-hy基因的相对表达水平。

1.2.6 不同乙醇浓度下CLA相关基因转录水平和CLA转化率之间的相关性

分析不同乙醇浓度下，CLA相关基因转录水平和CLA转化率之间的相关性。

1.2.7 CLA合成相关相关酶的系统进化树

通过MEGA 7.0绘制不同来源的CLA-HY、CLA-DH、CLA-DC、CLA-ER和Eno的系统发育树，来进一步分析L. plantarump-8与哪一种乳酸菌的CLA生成的相关酶系更接近。

1.2.8 数据处理

所有实验平行三次，采用Excel 2010和SPSS 18.0软件对数据进行分析处理，结果均以“平均值±标准误”（X±SD）表示，各组间的比较采用单因素方差分析，采用LSD法分析差异显著性，p＜0.05为差异显著。

2 结果与讨论

2.1 结果

2.1.1 LA对L. plantarump-8生长的影响

图1 不同LA浓度时植物乳杆菌p-8不同生长期的菌落数Fig.1 Colony number ofLactobacillus plantarum p-8 at different growth stages under different LA concentrations

采用活菌计数法对培养不同时期的植物乳杆菌p-8进行菌落计数，所得实验数据结果如图1所示。

植物乳杆菌p-8在LA浓度为0 mg/mL～0.04 mg/mL时，随着LA浓度的升高，活菌数量波动较小，活菌数量基本未受到抑制，而LA浓度大于0.05 mg/mL时，活菌数量收到抑制，因此LA浓度选取为0.05 mg/mL。

2.1.2 标准样品和待测样品的色谱图

各标样和待测样品GC图谱如图2所示，检测到标准样品c9,t11-CLA、t10,c12-CLA、t9,t11-CLA、LA、十七碳烷酸分别在27 min、28 min、29 min、23 min和20 min左右出峰，待测样品中CLA的转化率并不高。

图2 各标准脂肪酸和转化产物气相色谱图Fig.2 Gas chromatograms of various standard fatty acids and conversion products

2.1.3 不同乙醇浓度胁迫下L. plantarump-8的CLA转化率差异性

图3 不同浓度乙醇胁迫下发酵液中三种CLA的转化率Fig.3 Three CLA conversion rates in fermentation broth with different concentration ethanol stress

7个不同浓度乙醇胁迫下L. plantarump-8发酵液中不同CLA异构体的转化率结果如图3。三种CLA异构体转化率都是在添加0.50%乙醇时最高，其中转化t9,t11-CLA异构体最高，为2.49%。是不添加乙醇的2.37倍。添加不同浓度乙醇的发酵液中t10,c12-CLA转化率都是最低的。这与赵微等[18]报道的菌体催化发酵液中CLA是c9,t11-CLA最高（转化率2%）t9,t11-CLA（转化率0.90%）最低不一致，原因有待于进一步研究。

图4 乙醇胁迫下菌体中三种CLA的转化率Fig.4 Three CLA conversion rates in bacteria under different concentrations ethanol stress

7个添加不同乙醇浓度的菌体中不同CLA异构体的转化率如图4，总体来看，菌体中产生的CLA非常少，但规律与发酵液的基本一致。添加0.50%乙醇菌体中c9,t11-CLA转化率最高，仅为0.05%，但比不添加乙醇的高5倍。当乙醇浓度高于0.50%时，随着乙醇浓度增加，各种不同CLA异构体的转化率逐渐减少。比较同种处理发酵液和菌体中CLA各异构体的转化率，可以看出由LA转化生成的CLA主要分布在发酵液中。Kishino等[18]发现催化LA转化为CLA的亚油酸异构酶系的三个酶中CLA-HY在细胞膜上，CLA-DH和CLA-DC都分布在细胞液中，说明CLA是在胞液内产生后再被运转到胞外的。

2.1.4 不同乙醇浓度胁迫下L. plantarump-8的RNA提取结果

图5 不同浓度乙醇胁迫下植物乳杆菌p-8 RNA电泳检测Fig.5 The RNA agarose gel electrophoresis ofL. plantarum p-8 under different ethanol concentrations stress

L. plantarump-8在添加乙醇浓度分别为0、0.50、1.50和3%四个浓度胁迫下培养到对数期，提取RNA经电泳检测的结果如图5，四个样品均出现清晰的三条带，符合RT-qPCR的要求。

2.1.5L. plantarump-8在四种乙醇浓度胁迫下CLA合成相关酶基因的转录水平差异性

乙醇胁迫影响了CLA的转化率，为了探明其原因，根据四种乙醇浓度胁迫下16S rRNA内参基因及cla-hy、cla-dh、cla-dc、cla-er和cla-enoRT-qPCR的扩增曲线，分别得到它们的Ct值，结果如表1。根据Ct值计算各基因的mRNA相对表达量并进行比较，发现四种乙醇浓度胁迫下，cla-hy、cla-dh、cla-dc、cla-er和cla-eno的mRNA相对表达情况如图6，在0.05 mg/mL LA诱导下cla-hy、cla-dh和cla-dc的mRNA相对表达量分别为2.54、0.89和0.77，乙醇浓度在0.50%时，cla-hy的mRNA相对表达量最大为2.54。这与杨波[11]报道的植物乳杆菌ZS2058为代表的高产CLA乳酸菌对数期（10 h）与CLA合成相关的几个酶基因表达都在7以上，相对较高；Lactobacillus plantarumST-III等低产CLA菌株对数期（10 h）cla-hy表达量在4以上，而cla-dh和cla-dc相对表达量不足2，说明亚油酸异构酶系的几个酶基因表达水平高，CLA生成量就高。乙醇浓度在1.50%和3%时，基因表达量均下降。LA对细菌有毒性，是一种毒力因子，通过转变LA为CLA可解除毒性。本文这种CLA低转化率可能与L. plantarump-8细胞膜的脂肪酸组成有关，可能饱和脂肪酸偏高，细胞膜的通透性差，LA不易进入细胞内，对细胞毒害相对较低，也就不会大量诱导cla-hy的表达催化LA转化为CLA来解毒。

图6 四种乙醇浓度胁迫下相关酶基因的表达水平Fig.6 Expression level of related enzyme genes under three ethanol concentration stress

表1 L. plantarump-8在四种乙醇浓度胁迫下CLA合成相关酶基因及16S rRNA RT-qPCR的Ct值Table 1 Ct value of RT-qPCR for related enzyme gene to CLA synthesis and 16S rRNA inL. plantarump-8 under four ethanol concentration stress

表2 不同乙醇浓度下CLA相关基因转录水平和CLA转化率之间的相关性Table 2 The difference between the transcription level of CLA-related genes and the conversion rate of CLA under different ethanol concentrations

在相同浓度乙醇胁迫下cla-dh和cla-dc的mRNA相对表达量都基本接近，与从genebank上L. plantarump-8的基因组序列中查到的cla-dh和cla-dc为一个转录单位的信息相吻合。而cla-hy在相同乙醇浓度胁迫下要高出cla-dh和cla-dc的mRNA相对表达量1.53倍，说明cla-hy首先对乙醇作出反映的，如同首先对LA做出反映一样。cla-dh和cla-dc必须在有较高浓度的cla-hy催化产物10-羟基十八碳烯脂肪酸作用下才可以被诱导大量表达。

2.1.6 不同乙醇浓度下CLA相关基因转录水平和CLA转化率之间的相关性

将不同乙醇浓度下CLA相关基因转录水平和CLA转化率之间的相关性进行比较，如表2，在0.50%乙醇浓度下：除了cla-er与CLA转化率不显著相关外其余基因都呈显著相关；在1.50%乙醇浓度下：只有cla-dh与CLA转化率呈显著相关，其余基因均呈不显著相关；在3%乙醇浓度下：多有基因与CLA转化率均呈显著相关。

2.1.7 亚油酸异构酶系相关酶蛋白的系统进化树分析

进化树可反映出各物种的进化与亲缘关系。分布在进化树同一分支，亲缘关系较近。利用MEGA软件构建了L. plantarump-8菌株以及其他菌株的五个CLA合成相关酶的进化树如图7～11，比较发现L. plantarump-8与ST-III亲缘关系最接近，所以，L. plantarump-8也应为低产CLA菌株，而本文与CLA合成相关酶的表达水平CLA转化率也较低，规律与杨波报道的Lactobacillus plantarumST-III相吻合，其中c9,t11-CLA的转化率为0.34，t10,t12-CLA的转化率为0.92，t9,t11-CLA的转化率为0.35；cla-hy相对表达量为4.50，cla-dh相对表达量为1，cla-dc相对表达量为1.40，cla-er相对表达量为1.40[11]，也与前期杜美婷报道的结果一致[19]。

图7 不同物种CLA-HY的系统进化树Fig.7 Phylogenetic tree of CLA-HY from different species

图8 不同物种CLA-DH的系统进化树Fig.8 Phylogenetic tree of CLA-DH from different species

图9 不同物种CLA-DC的系统进化树Fig.9 Phylogenetic tree of CLA-DC from different species

图10 不同物种CLA-ER的系统进化树Fig.10 Phylogenetic tree of CLA-ER from different species

图11 不同物种Eno的系统进化树Fig.11 Phylogenetic tree of Eno from different species

3 结论

同一条件下发酵液中CLA各异构体的转化率远比菌体中CLA各异构体的转化率高，说明CLA是在胞液内产生后再被运转到胞外的。cla-hy的mRNA相对表达在四种乙醇浓度下都最高的，是其他四个基因的1.50倍之多，乙醇浓度在0.50%时，相对表达量最大为2.54。低浓度的乙醇胁迫可以提高CLA合成相关酶基因的转录水平，原因是低浓度的乙醇只增加与细胞膜的亲和力，不使细胞死亡，容易使得细胞膜的透性增加，导致LA容易进入细胞内，而LAI是诱导酶，进入胞内的LA浓度高，诱导CLA合成相关酶基因的表达增加。CLA合成相关酶基因转录水平是造成CLA转化率差异的主要原因。