潜在益生作用乳酸菌的筛选鉴定及其生物学特性

何宇星，其其日力格，刘玮，段晓霞，邱崇顺，乌云达来*

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特 010018）（2.蒙牛乳业（集团）股份有限公司，内蒙古呼和浩特 011599）（3.联邦制药有限公司，内蒙古巴彦淖尔 015000）

“益生菌”是一类通过合理、足量的摄入后，对宿主产生有益作用的活性微生物[1,2]。其能改善机体肠道微生物菌群的平衡[3]、增强机体免疫力[4]、发挥抗氧化作用[5]、降低胆固醇水平[6]、缓解乳糖不耐症[7]等益生作用。而发挥益生作用的主要场所是肠道，例如与有害微生物竞争营养物质从而抑制其生长[8]，通过调节消化道微生态平衡，防止或减少机会致病菌的黏附，降低炎症反应、释放免疫因子等提高机体免疫力等[9,10]。但是只有耐酸、耐胆盐、通过胃肠道后能存活的益生菌，才能发挥在机体中的益生作用，因为强酸性的胃液环境，会杀死或抑制其活性[11]。为保证菌株的活性，须具有很强的耐酸能力，进而顺利抵达人体肠道，黏附并定殖在肠道内且发挥益生作用[12]。

酸马奶是益生菌来源的宝库，开发利用这种特定生态环境中的益生菌，具有重要的意义。因为其富含有益微生物、维生素和多种功能活性物质，蒙古族传统医学在此基础上创立了“酸马奶疗法”[13]，其营养物质含量及比例适宜人体消化吸收，因其具有辅助治疗冠状动脉硬化、贫血，提高免疫力，降血压、血脂等功效，享有很高的知名度和市场占有率[14]。而且酸马奶在世界各地已有很久的食用历史，经过长期的自然选择作用，优质的乳酸菌菌种逐渐流传下来，是获得优质乳酸菌的良好来源[15,16]。因此，分离酸马奶中的益生菌，具有重要的意义和前景。

本文对蒙古国牧区酸马奶样品中分离的乳酸菌通过耐酸、耐胆盐、耐模拟人工胃肠液、抗生素药敏试验以及细胞表面疏水性等试验进行潜在益生菌的筛选研究，最终选定一株优势菌株进行菌种鉴定，该研究结果为开发优良的潜在益生菌菌株提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 菌株与主要试剂

197株供试乳酸菌菌株均分离于蒙古国酸马奶样品[17]；HBI乳酸菌生化鉴定条，青岛海博生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；抗菌药物药敏纸片，常德比克曼生物科技有限公司。

1.2 试验菌株的准备

1.2.1 活化菌株

将-80 ℃甘油保藏的菌株按2%（V/V）的接种量接种到MRS液体培养基，37 ℃培养16～18 h，连续活化3代后用于后续试验。

1.2.2 供试菌液的制备

第三代活化的菌株离心后（5000r/min，8 min)，用灭菌PBS缓冲溶液清洗3次，调至菌悬液浓度为1.0×109CFU/mL，备用。

1.3 活菌数的测定

参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[18]的方法，取1.0 mL供试菌液与9.0 mL的0.9%的生理盐水混匀，依次梯度稀释至10-7、10-8、10-9，取稀释液1.0 mL，用46±1 ℃的MRS琼脂培养基，倾注法测定乳酸菌活菌数，每个稀释梯度做2个平皿。

1.4 潜在益生作用乳酸菌的筛选

1.4.1 耐酸性试验[19]

将197株乳酸菌按照1.2.2中方法制备供试菌液，分别接种于pH值为2.0、2.5、3.0的MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养16～18 h，以未接种的MRS液体培养基为空白对照，测量OD595nm值，挑选耐酸性较好的菌株进行后续试验。

1.4.2 耐胆盐能力试验[20]

在1.4.1中筛选耐pH 2.0的乳酸菌，按照1.2.2的方法制备供试菌液，将菌液按2%（V/V）的接种量接入到胆盐添加浓度为0.3%（m/V）的MRS液体培养基中37 ℃培养16～18 h，测定其在OD630nm值，同时划线培养于胆盐浓度为0.3%（m/V）的MRS固体培养基，37 ℃培养16～18 h，并观察菌落生长情况。

1.4.3 耐模拟人工胃液试验

将耐酸性和耐胆盐能力良好的菌株连续培养三代，按照文献[21]的方法微调整，将菌液离心（3000 r/min、10 min）后收集菌泥，用灭菌生理盐水离心洗涤2次，将5.0 mL生理盐水加入到菌泥中，混匀制成菌悬液，各取1.0 mL菌悬液分别接种于9.0 mL经0.22 μm滤菌膜处理后pH 2.0的模拟人工胃液试管中，充分混匀后37 ℃下厌氧培养。在实验开始0 h和3 h后分别取样，测定其活菌数（CFU/mL）。选择大于80%的菌株进行后续试验。

1.4.4 耐模拟人工肠液试验

根据文献[22]中的方法微调整，将模拟人工胃液试验中处理3 h后的菌液，接种于经过滤除菌的模拟人工肠液（pH 8.0）中，37 ℃下培养，并分别于0 h、4 h、8 h时测定其活菌数（CFU/mL）。

人工肠液：将下述a液和b液以2:1比例混合。

a、胰腺液：NaHCO31.1%、NaCl 0.2%、胰蛋白酶0.1%，调整pH值为8.0后，过滤除菌备用。

b、胆液：牛胆盐1.2%，调整pH值为8.0后，过滤除菌备用。

1.5 潜在益生菌的益生特性研究

1.5.1 细胞表面疏水性的测定[23]

将1.4.4中筛选的潜在益生作用菌株活化2代后，接种于无菌MRS培养基中37 ℃培养16～18 h，离心（9500 r/min，4 ℃，10 min）收集菌体，用50 mmol/L磷酸盐缓冲液离心洗涤2次，将沉淀用缓冲液悬浮。以缓冲液为空白对照，调整菌体浓度，使其初始浓度在600 nm波长处吸光度约为1.0。取4.0 mL调整浊度后的菌液，加入0.8 mL二甲苯，高速涡旋2 min，静置10 min分层，取下层水相在600 nm波长处测其吸光度。按如下公式计算乳酸菌细胞表面疏水性：

式中：

A0、A——与二甲苯混匀前、后菌液在600 nm处的吸光度。

1.5.2 抗生素药敏试验

表1 抗生素的种类、药敏纸片含药量及抑菌圈直径判断标准Table 1 Types of antibiotics, drug content of drug sensitive discs and criteria for determining the diameter of inhibition zone

采用K-B纸片琼脂扩散法[24]，取200 μL潜在益生菌菌液在MRS固体培养基中进行涂布，待平板表面稍干，将抗生素纸片均匀间隔放置于表面上，共10种抗生素（氨苄西林、头孢拉定、红霉素、四环素、庆大霉素、万古霉素、链霉素、氯霉素、诺氟沙星、克林霉素），置于37 ℃恒温培养24 h后用游标卡尺测量抑菌圈直径（mm）。

1.6 潜在益生菌的菌种鉴定

1.6.1 菌落形态观察

将活化三代的潜在益生菌划线接种于MRS固体培养基上，37 ℃恒温培养48 h，挑取单个菌落进行革兰氏染色观察菌株和菌落形态[25]。

1.6.2 糖类发酵试验

根据HBI乳酸菌生化鉴定条的使用说明书，将潜在益生菌进行生理生化鉴定。37 ℃培养24～48 h，培养结束后观察并做记录。

1.6.3 分子生物学鉴定

将潜在益生菌接种于MRS液体培养基中，37 ℃培养12 h后，8000 r/min离心1 min收集菌泥，按照细菌基因组DNA提取试剂盒的方法提取乳酸菌基因组DNA。提取的基因组DNA采用1%琼脂糖凝胶电泳分析。

16S rDNA基因的PCR扩增[26]：提取的乳酸菌基因组DNA做模板，选择16S rDNA基因通用引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行16S rDNA基因序列的PCR扩增。扩增条件：95 ℃，5 min→95 ℃，30 s→55 ℃，30 s→72 ℃，90 s，34个循环；72 ℃，5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析并送至上海生工生物工程有限公司进行测序，将测序结果在GenBank数据库进行Blast分析，并用MEGA 7.0绘制系统发育树。

1.7 数据处理

每组试验重复三次，用SPSS 23.0对试验数据进行统计分析处理，所有数值用平均值±标准误差表示，用Excel及Origin 8.5进行做图。

2 结果与分析

2.1 耐酸性试验

将197株乳酸菌分别接种于pH值为2.0、2.5、3.0的MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养16～18 h，筛选出10株存活较好的菌株，试验结果见表2。

人体胃液中胃酸的主要成分为盐酸，其pH值通常为3.0左右，在空腹情况下pH值可达1.5，只有少数具有良好耐酸能力的乳酸菌以活菌形式通过胃酸屏障并到达胃肠道发挥作用，而食物在胃中停留时间低于3 h，液体则更短[27]。虽然在pH值为3.0的条件下，菌株在胃液环境中可保持活性，但是本试验为筛选出性能更加优异的菌株，因此选定耐pH值为2.0并保持很高活性的10株优势乳酸菌，进行后续的试验。

表2 10株乳酸菌在不同pH环境中生长情况Table 2 Growth of 10 strains of lactic acid bacteria in different pH environments

2.2 耐胆盐能力试验

将10株耐酸性较好的乳酸菌，接种于胆盐添加浓度为0.3%（m/V）的MRS液体培养基，37 ℃培养16～18 h后测定其在OD630nm值，同时划线于胆盐浓度为0.3%（m/V）的MRS固体培养基上，试验结果见表3。

表3 乳酸菌在0.3%胆盐环境中生存情况Table 3 Survival of lactic acid bacteria in 0.3% bile salt environment

OD630nm值大于0.5，说明菌株在添加0.3%的胆盐环境中长势良好，具有很好的胆盐耐受性[28]。由表中数据可知，10株菌均有不同的耐胆盐能力，其中菌株49、菌株2-7、菌株2-8、菌株2-20耐受能力较低，菌株2-2、菌株2-13、菌株2-21和菌株2-32耐受能力较好，菌株2-18和2-33耐受能力最好。而正常人体肠道中胆盐质量分数在0.03%～0.3%之间波动[29]，这与熊荣园[30]筛选的一株降解铅的乳酸菌对胆盐耐受能力结果相似。发挥益生作用的乳酸菌，不仅需要具有良好的耐酸性能、耐胆盐能力，还需具备通过胃液这样强酸性的生物屏障，这样才能顺利到达小肠而发挥益生作用，因此对筛选出的10株乳酸菌进行模拟人工胃液试验。

2.3 耐模拟人工胃液试验

将2.2中筛选的10株乳酸菌接种于pH值2.0的模拟人工胃液中，于0 h和3 h进行活菌计数（CFU/mL），结果见表4。

表4 乳酸菌耐模拟人工胃液耐受性Table 4 Lactic acid bacteria tolerance simulated artificial gastric juice tolerance

由表4可知，10株菌在胃液中的存活率均不一样，存活率在80%以上的有3株菌，分别为菌株2-13，菌株2-32，菌株2-33，因此选取这3株菌进行下一阶段试验，其中菌株2-33存活率最高，可达95.86%。据研究报道，陈明[31]在乳酸菌耐模拟人工胃液试验中，筛选出的11株具有高抗氧化能力的乳酸菌，模拟胃液中存活率均在80%以上。

2.4 耐模拟人工肠液试验

通过耐模拟人工胃液筛选的3株菌在模拟人工肠液试验结果如表5。

表5 菌株耐模拟人工肠液耐受性Table 5 Resistance of strain to simulated artificial intestinal fluid

由表5可知，将3株菌先在模拟人工胃液里消化3 h再转到pH 8.0的人工肠液，在前4 h内3株菌的活菌数下降不明显，培养至8 h菌株2-13的活菌数下降了一个数量级，其余2株菌的活菌数下降不明显。通过模拟人工肠液中培养8 h可知，3株菌均保持着较高的存活率，最低为66.51%，最高可达80.80%，说明3株菌对模拟人工肠液有一定的适应能力，这一结果与于海静[32]、鲍雅静[33]等人的结果相似。

2.5 细胞表面疏水性的测定

对通过模拟人工肠液筛选的3株菌，进行细胞表面疏水性的测定，结果如图1。

图1 3株乳酸菌细胞表面疏水率测定Fig.1 3 strains of lactic acid bacteria cell surface hydrophobicity rate

细菌在烃-水两相分离过程中发生了疏水分配，因而可根据水相中细菌细胞数量的变化来了解细胞表面的疏水性[34]。由图1可知，3株菌的细胞表面疏水性范围在2.80%～42.61%之间，其中菌株2-33的疏水率最高，可达42.61%，其余两株菌的疏水率均低于20%。不同菌株的疏水性差别较大，这与大多数文献报道的一致，由此可见菌株2-33对二甲苯的吸附能力比较强，其次是菌株2-32，再次是菌株2-13。细胞表面疏水性是决定乳酸菌非特异性粘附的重要动力[35]，疏水性好代表着粘附能力较强，因此，选定菌株2-33为目的菌株。

2.6 抗生素药敏试验

目的菌株对抗生素越敏感，在药敏纸片周围的活性越弱，形成的透明圈即抑菌圈越大[36]，菌株2-33对10种抗生素药敏的结果如表6。

从表6可知，菌株2-33对诺氟沙星、头孢拉定、庆大霉素、万古霉素以及链霉素有耐药性，不敏感；对克林霉素中度敏感；对四环素、氯霉素、红霉素、 氨苄西林敏感。

表6 抗生素敏感试验Table 6 Antibiotic sensitivity test

2.7 菌落形态观察

将活化好的菌株2-33划线于MRS固体培养基上，恒温培养（37 ℃，48 h），挑取单个菌落进行革兰氏染色并观察菌株形态，菌种在MRS固体培养基上菌落呈圆形、边缘整齐、表面光泽、不透明且颜色为乳白色；经革兰氏染色，显微镜观察结果为杆状革兰氏阳性菌，结果如图2所示。

图2 菌株2-33菌落形态及菌体形态Fig.2 Bacterial colony morphology and bacterial body morphology of strain 2-33

表7 糖类发酵实验Table 7 Sugar fermentation experiment

2.8 糖类发酵实验[37]

将菌株2-33的单菌落混悬于2 mL生理盐水中制成菌悬液，将其加入到糖类培养基中，37 ℃培养24～48 h后观察的结果如表7。

由表7可知，菌株2-33可利用七叶苷（由紫色变黑色）及其他糖类（均变成黄色），结果判断均为阳性。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[38]和《常见细菌系统鉴定手册》[39]菌株2-33利用所选糖类的特性与植物乳杆菌的特性相同，因此初步鉴定菌株2-33为植物乳杆菌。

2.9 潜在益生菌株的16S rDNA基因序列分子鉴定

根据细菌基因组DNA试剂盒提取方法进行了菌株2-33的基因组DNA提取，并进行16S rDNA序列的PCR扩增。送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定，结果见图3。

图3 菌株2-33的16S rDNA因序列Fig.3 16S rDNA gene sequence of strain 2-33

图4 菌株2-33的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain 2-33

将菌株2-33的16S rDNA基因测序结果在GenBank数据库进行Blast分析，用MEGA 7绘制系统发育树，结果如图4所示。

由图4可知，2-33与L. plantarum聚类，且与L. plantarumJCM1149具有最高的同源性且达到100%。菌株2-33的16S rDNA分子鉴定结果与糖类发酵实验结果一致，因此，鉴定菌株2-33为植物乳杆菌。

3 结论

益生菌在体内发挥益生作用的前提条件是能够顺利通过胃酸和胆盐所构成的生物屏障，保证有足够数量的活菌稳定黏附于肠道上皮细胞从而实现定植，进而可以充分发挥益生作用。本文通过耐酸性试验、耐胆盐能力试验、耐模拟人工胃肠液试验以及细菌表面疏水性测定后，选取在模拟人工胃液中存活率达95.86%、模拟人工肠液中存活率达80.80%、疏水性为42.61%的菌株2-33为目的菌株。经抗生素药敏试验可知，菌株2-33对诺氟沙星、头孢拉定、庆大霉素、万古霉素以及链霉素有耐药性，不敏感；对克林霉素中度敏感；对四环素、氯霉素、红霉素、氨苄西林敏感，该项试验的进行，对评价菌株的安全性具有重要意义。最后经分子生物学确定的菌株2-33为植物乳杆菌，与L. plantarumJCM1149同源性达100%，且菌株2-33的糖类发酵试验结果与GB 4789.35-2016一致。本研究结果对可定植胃肠环境的功能性乳酸菌资源开发提供了参考和理论数据。