植物乳杆菌DMDL 9010降解亚硝酸盐特性 及其相关基因挖掘

黄燕燕，刘冬梅，邝嘉华，周钦育，陈宇瀚，高璇，塔尼娅，周杨

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

亚硝酸盐（Nitrite，NIT）是一种在氮循环中起重 要作用的化合物[1]，作为护色剂和防腐剂被广泛用于食品行业，同时它可与酯或其他药用盐等组合，形成药制剂[2]。然而，过量摄入亚硝酸盐会引起急性中毒等症状。目前国家已经规定了亚硝酸盐在食品中的最大使用量，但由于亚硝酸盐的不当使用、环境污染以及污染物残留等原因，导致食品中残留的亚硝酸盐偏高[1]，严重危害人们的身体健康。

现今发现，生物法降解亚硝酸盐已成为国内外研究的热点[3-5]。例如，乳酸菌和少数芽孢杆菌等微生物已被证明具有降解亚硝酸盐的作用，其中，乳酸菌是目前降解亚硝酸盐最常见的微生物，包括Levilactobacillus brevis、Lactiplantibacillus plantarum等[6]。乳酸菌降解亚硝酸盐的机理主要包括酸降解、酶降解和抑制有害菌生长，从而减少亚硝酸盐的产生[7-11]。杨晶等[7]研究了Lactiplantibacillus plantarum5-7-3在发酵过程中产生的各种有机酸含量与亚硝酸盐含量进行相关性分析，发现不同有机酸对亚硝酸盐的降解效果不同，效果最好的是苹果酸和乳酸，效果最不明显的是柠檬酸。乳酸菌在发酵过程中除了可以产生有机酸之外，还能产生亚硝酸盐还原酶（Nitrite reductase，NiR）来高效降解亚硝酸盐[8]。卢海强等[9]在从东北传统发酵酸菜中筛选出的多株乳酸菌中分离出了高活力的NiR，推测亚硝酸盐诱导乳酸菌产生NiR[10]，但不同乳酸菌分离出的NiR的活性不同。此外，乳酸菌可产生一种叫做细菌素的蛋白质，能够抑制多种有害菌生长[11]，进而抑制硝酸盐转化为亚硝酸盐，故细菌素的存在能够抑制亚硝酸盐的产生，也能防止食品腐败。

本课题组前期研究发现植物乳杆菌DMDL 9010（Lactiplantibacillus plantarumDMDL 9010，LP9010）具有高效降解亚硝酸盐的能力，但其具体机理尚未明确，尤其是从基因层面挖掘其高效降解亚硝酸盐的基因。本文将通过研究不同培养条件和培养基成分对LP9010在不同培养条件和培养基成分下理化指标（pH、酸度、活菌数和亚硝酸盐降解率）的变化，结合全基因组分析LP9010降解亚硝酸盐的相关基因，为植物乳杆菌降解亚硝酸盐的机理提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌DMDL 9010，由华南理工大学食品科学与工程学院食品质量与安全系筛选分离并保存[12,13]。

MRS肉汤，技术琼脂粉，酵母提取粉，购于广东环凯微生物科有限公司；无水葡萄糖，蔗糖，亚硝酸钠，购于天津市大茂化学试剂厂；对氨基苯磺酸，盐酸萘乙二胺，浓盐酸（37%，m/V），硝酸铵，磷酸二氢钠，磷酸氢二钾，磷酸，氢氧化钠，购于广州化学试剂厂；玉米淀粉，大豆蛋白，苹果，番茄，胡萝卜，均为食品级，购于广州西亚兴安超市。其他试剂均为分析纯。

超净工作台（MK3型），上海日岛科学仪器有限公司；生化培养箱（LRH-250A-II），韶关市泰宏医疗器械有限公司；高速冷冻离心机（JW-3021HR），安徽嘉文仪器装备有限公司；多功能酶标仪（680型），美国Bio-Rad公司；pH计（FiveEasy Plus型），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；电热恒温干燥箱（DHG-9194A型），上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化

将甘油管中保存的LP9010菌液接种于MRS液体培养基中（接种量4%，V/V），于37 ℃下活化12 h。

1.2.2 LP9010文库构建、测序与组装

LP9010基因组DNA由深圳华大基因研究所提取，使用华大基因公司的BGISEQ平台和PacBio平台进行全基因组测序。BGISEQ实验流程包括用Covaris仪超声波打断DNA样品，获得符合长度要求的短DNA片段。使用Qubit dsDNA HS Assay Kit 500 assays试剂盒检测纯化DNA样品后，进行PCR获得最终文库并进行测序。PacBio平台实验流程包括用g-TUBE将DNA处理成大小适当的片段，使DNA片段形成哑铃结构的SMRTbell，与聚合酶混合后进行测序。对原始测序数据进行过滤处理，保证信息分析结果可靠性，以得到更精确的组装结果。

1.2.3 不同培养条件对LP9010降解亚硝酸盐的影响

1.2.3.1 不同培养pH对LP9010降解亚硝酸盐的影响

用缓冲溶液（2 mol/L磷酸二氢钠、2 mol/L磷酸氢二钾、50%磷酸）将MRS液体培养基的pH分别调至2.0、3.0、4.0、5.0，设置自然pH组（pH=5.8）为空白对照，灭菌。用无菌100 g/L NaNO2溶液调培养基的NaNO2浓度至0.2 mg/mL（下同），接菌（按4%的接种量接种一次活化后的LP9010，下同）后于37 ℃下培养12 h，于0、4、8、12 h取样测定活菌数以及NaNO2降解率。

1.2.3.2 不同培养温度对LP9010降解亚硝酸盐的影响

接菌后设置20、30、37、40和50 ℃下培养12 h，于0、4、8、12 h取样测定pH值、酸度、活菌数以及NaNO2降解率（见1.2.4）。

1.2.3.3 氧气对LP9010降解亚硝酸盐的影响

接菌后分别装于带封瓶膜的锥形瓶（有氧培养：220 r/min培养）以及带旋盖的试剂瓶（无氧培养：静置培养）中，37 ℃下培养12 h，于0、4、8、12 h取样测定pH值、酸度、活菌数以及NaNO2降解率。

1.2.4 不同培养基成分对LP9010降解亚硝酸盐的影响

按表1配方配制培养基，其中玉米淀粉组配制方法为：称取一定量玉米淀粉（5%，m/V）和酵母提取粉（3%，m/V）溶于蒸馏水中，85 ℃搅拌30 min。生长因子组配制方法为：果蔬洗净去皮后榨成渣（不加水），纱布包住果蔬渣挤出汁液，巴氏杀菌（85 ℃，15 min）。其他步骤相同如下，在蒸馏水中加入碳源、氮源和生长因子配成培养基，灭菌（121 ℃，15 min）冷却后，再加入0.2 mg/mL NaNO2，接菌后于37 ℃下培养48 h，于0、6、12、24、36、48 h取样测定菌液的pH值、酸度、活菌数以及NaNO2降解率。

表1 简单培养基配方Table 1 Simple medium formulations

1.2.5 理化指标的测定

1.2.5.1 pH的测定

用电子pH计测量。

1.2.5.2 酸度的测定

参考Huang等[14]方法，取1 mL菌液于锥形瓶中，加入两滴酚酞试剂，用0.10 mol/L NaOH滴定。

式中：

V1——NaOH消耗的体积；

V2——样品量；

c——NaOH浓度，0.10 mol/L。

1.2.5.3 活菌数的测定

乳酸菌存活计数参考Huang等[14]人的研究并作稍微调整。将每个样品（100 μL）在无菌生理盐水（0.9%）中进行梯度稀释。将稀释的100 μL细菌溶液在MRS琼脂平板中于37 ℃孵育24 h并计算乳酸菌菌落数lg(CFU/mL)。

1.2.5.4 亚硝酸盐降解率的测定

取样加2 mL对氨基苯磺酸溶液混匀，静置5 min后加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液（2 g/L），加水至刻度摇匀，静置15 min，在538 nm处测定反应液的吸光度，利用标准曲线方程Y=0.0023X-6×10-5（Y为吸光值，X为亚硝酸钠含量，回归系数R2=0.9971）计算出亚硝酸盐的含量（g/L）。

式中：

A——试样原始亚硝酸盐含量，g/L；

B——反应后亚硝酸盐含量，g/L。

1.2.6 数据处理与分析

每个实验重复3次，SPSS 16.0软件分析数据，Origin 9.1软件绘图。数据表示为平均值±标准偏差。

2 结果与分析

2.1 LP9010基因组测序分析

由图1a可知琼脂糖凝胶电泳得到了一个1500 bp左右的条带清晰单一的电泳带，与课题组前期鉴定结果相一致[12]。采用深圳华大基因研究所的Illumina平台和PacBio RS II平台进行测序，由于原始测序数据可能包含低质量序列、接头序列等，通过过滤杂质，从而得到高质量Clean Data。根据平台测序结果进行GC-Depth分析，展现样品的GC含量及深度分布，可以判断样品是否有污染以及测序过程的随机性等。图1b可知样品的GC含量与样品Depth分析统计图符合泊松分布，表明样品GC含量没有偏向性，测序随机性良好。最后，LP9010的基因组序列提交NCBI，登录号为CP063986-CP063988[13]。

图1 LP9010基因组测序分析Fig.1 The sequencing analysis of LP9010 genome

2.2 不同培养pH对LP9010降解亚硝酸盐的影响

根据图2，各组pH（由低至高）在12 h时的亚硝酸盐降解率分别为100.00、100.00、91.39和82.18%（图2c）。在4 h时自然pH组的pH为5.68（图2a），其亚硝酸盐降解率（16.18%）低于pH 5.0组（47.11%）（图2c）；12 h时自然pH组的pH降为4.02（图2a），其亚硝酸盐降解率（90.08%）高于pH 5.0组（82.13%）（图2c）。这说明pH越低时亚硝酸盐降解率越高（pH≥4.00），具有明显的规律性。在4 h时，pH 2.0和pH 3.0组的活菌数均为0.00 CFU/mL（图2b），亚硝酸盐降解率均达到100.00%（图2c）。当pH＜4.00时LP9010无法生存（图2b），此时亚硝酸盐主要为酸降解[8]。

图2 不同培养pH对LP9010降解亚硝酸盐的影响Fig.2 Impact of different culture pH on the nitrite degradation by LP9010

通过查找LP9010全基因组序列（表2）中影响菌株耐酸性相关的基因，发现LP9010中具有编码完整的质子泵F0F1-ATPase系统的基因以及Na+/H+逆向转运蛋白的基因，能够通过消耗细胞内的ATP将H+泵出细胞外。此外，谷氨酰胺脱羧酶（GAD）系统和苹果酸发酵脱羧过程也与菌株的耐酸性密切相关[15]，在LP9010中也发现了谷氨酰胺脱羧酶和精氨酸琥珀酸合酶ASS1。有研究表明基因glnR缺失的菌株在酸性条件下存活率明显高于正常菌株[16]，在基因组中也找到了与之相关的基因AGL001420。但是结合上述菌株酸耐受性实验分析，LP9010的酸耐受性并不强，在弱酸条件下能够良好生长，强酸条件下生长受到明显抑制，从而影响LP9010对亚硝酸盐的降解。

表2 LP9010中基因列表Table 2 The lists of Genes in LP9010

2.3 不同培养温度对LP9010降解亚硝酸盐的影响

根据图3，相比于其他温度，37 ℃最适合LP9010生长繁殖、产酸以及降解亚硝酸盐，此温度下在培养12 h时pH最低（4.01）（图3a）、酸度最高（138.44 °T）（图3b）、活菌数最大（1.23×109CFU/mL）（图3c）以及亚硝酸盐降解率最高（90.01%）（图3d）。LP9010正常生长时产生的酸可以降解亚硝酸盐[11]，但低温和高温均会抑制LP9010的生长和产酸（图3），从而抑制亚硝酸盐的降解。20、30、37、40 ℃组的酸度变化均为先下降后上升，这是因为酸会通过下述反应降解亚硝酸盐[17]：H++NO2-→HNO2（对热不稳定）→N2O3（对热不稳定）→NO+NO2。在生长前期LP9010生长繁殖缓慢，分泌有机酸的速率低于其被消耗的速率，酸度下降；后期LP9010繁殖速度加快，有机酸分泌速率高于其被消耗的速率，酸度上升。

此外，在LP9010中还发现一些与冷热耐受性相关的基因（表3），例如与耐热相关的clp蛋白酶亚单位基因cplC、clpE、clpP、clpX和clpL等，编码冷应激蛋白cspA（AGL000029、AGL000821和AGL000956）的基因等。结合上述实验菌株冷热耐受性分析，推测在20 ℃和40 ℃条件下培养8 h后菌株生长速度加快与菌株冷热应激蛋白的表达有关，在低温和高温的刺激下，应激蛋白的表达提高了菌株对极端温度的耐受性。

图3 不同培养温度对LP9010降解亚硝酸盐的影响Fig.3 Impact of different culture temperatures on the nitrite degradation by LP9010

表3 LP9010中基因列表Table 3 The lists of Genes in LP9010

表4 LP9010中基因列表Table 4 The lists of Genes in LP9010

2.4 氧气对LP9010降解亚硝酸盐的影响

由图4，12 h时有氧组和无氧组的pH分别为4.01和3.99（图4a），酸度分别为138.44 °T和144.95 °T（图4b），活菌数分别为1.28×109CFU/mL和7.40×108CFU/mL（图4c），亚硝酸盐降解率分别为90.12%和92.87%（图4d）。可看出各项指标无明显差异（p＞0.05），这是因为乳酸菌的代谢类型为兼性厌氧，有无氧气下均可正常生长繁殖[18]。但氧气的存在可能会影响其代谢过程，故两组的产酸以及亚硝酸盐降解率均有细微差别。在LP9010全基因组（表4）中，发现了与过氧化氢还原酶表达相关的基因AGL003162和与超氧化物歧化酶表达相关的基因AGL001327。在硫化物代谢过程中发现了由AGL000611和AGL002295编码的硫氧还蛋白还原酶trxB，由AGL000220、AGL002017、AGL002333、AGL003045和AGL003275编码的硫氧还蛋白trxA，trxB和trxA在抵抗氧化应激中产生重要作用[19]。在谷胱甘肽代谢途径中发现了编码谷胱甘肽还原酶gor的基因，该酶能够将谷胱甘肽二硫化物还原为谷胱甘肽（GSH），GSH通过转录调控清除自由基以提升氧耐受性。此外，基因AGL002068编码的L-甲硫氨酸（R）-S-氧化物还原酶msrC、基因AGL001131、AGL001649和AGL001772编码的肽-甲硫氨酸（S）-S-氧化物还原酶msrA和基因AGL001650编码的肽-甲硫氨酸（R）-S-氧化物还原酶msrB能够有效降低过氧化氢对菌株的损伤。结合氧气对实验菌株生长情况影响的分析，推测LP9010的氧气耐受性可能与上述超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等酶类的表达有关，接下来仍需进一步验证。

2.5 不同碳源对LP9010降解亚硝酸盐的影响

在乳酸菌降解亚硝酸盐的代谢过程中，糖类物质除了发挥提高肉制品的风味和色泽的作用外，还是乳酸菌代谢过程中所需的碳源，因此它直接影响着乳酸菌对亚硝酸盐的降解。从图5可看出空白组、葡萄糖组、蔗糖组和玉米淀粉组的pH变化无明显差异（p＞0.05），均为先下降后稍有回升（图5a）；酸度较低，均在6.00 °T以下（图5b）；四组的活菌数先上升，在6 h时升至最高值（3.19×107CFU/mL）后快速下降，其中玉米淀粉组的活菌数在24 h时降为0.00 CFU/mL，而其他三组的活菌数在12 h时降为0.00 CFU/mL（图5c）。在48 h时空白组、葡萄糖组和蔗糖组的亚硝酸盐降解率在25.00%以下，玉米淀粉组的亚硝酸盐降解率为50.59%（图5d）。由于糊化玉米淀粉易吸收，且含有脂肪、蛋白质、生长因子等营养物质[20]，故玉米淀粉组中LP9010存活时间较长。在培养前期（0～12 h）LP9010利用糖份快速生长产酸，导致pH快速下降（图5a）；但12 h之后活菌数开始下降，产酸减少，而酸被消耗用于降解亚硝酸盐，故pH略有上升[20]。空白组、葡萄糖和蔗糖组LP9010存活时间较短（12 h）（图5c），导致亚硝酸盐降解率较低；相比于其他组，玉米淀粉组中LP9010能更好地生长繁殖，因此亚硝酸盐降解率在48 h时明显高于其他组（p＜0.05）（图5d）。LP9010基因序列（表5）中pst I（PTS system enzyme I）由基因AGL001080编码，未发现编码HPr的相关基因。糖转运相关基因中，葡萄糖家族由EII A的Crr和EII B的NagE等转运，蔗糖由EII BCA的ScrA转运，甘露糖由EII A的MtlA和ManX、EII B的ManY和EII D的ManZ转运，半乳糖由EII A的GatA、EII B的GatB和EII C的GatC转运，果糖由EII B的FruA和EII A的FruB转运。葡萄糖和蔗糖组降亚硝酸盐率无明显差异（p＞0.05，图5），在整个LP9010的PTS系统中，只有蔗糖、甘露糖、半乳糖胺、半乳糖和果糖具有完整的代谢通路，这与表型（葡萄糖、蔗糖组）结果相一致。

图4 氧气对LP9010降解亚硝酸盐的影响Fig.4 Impact of oxygen on the nitrite degradation by LP9010

图5 不同碳源对LP9010降解亚硝酸盐的影响Fig.5 Impact of different carbon sources on the nitrite degradation by LP9010

表5 LP9010中基因列表Table 5 The lists of Genes in LP9010

图6 不同氮源对LP9010降解亚硝酸盐的影响Fig.6 Impact of different nitrogen sources on the nitrite degradation by LP9010

表6 LP9010中基因列表Table 6 The lists of Genes in LP9010

2.6 不同氮源对LP9010降解亚硝酸盐的影响

由图6，硝酸铵组中LP9010无法繁殖和产酸，pH保持在5.07～5.41内（图6a）、酸度在18.89～24.89 °T间（图6b）、活菌在0～6 h维持在6.50×105CFU/mL左右（图6c），在12 h时下降至0.00 CFU/mL（图6c），可见LP9010不能以硝酸铵为氮源，且对LP9010产生毒害作用[20]。其原因可能是高浓度无机盐使溶液渗透压变大，细胞失水营养物质流失，致使细胞皱缩，阻碍其生长过程。故此时LP9010无法生长和产酸，亚硝酸盐几乎不降解。在葡萄糖的基础上添加酵母提取粉能提升LP9010的生长繁殖和产酸，故亚硝酸盐降解率高；大豆蛋白组虽产酸少，但亚硝酸盐降解率在48 h时可达到85.62%（图6d），可能是因为LP9010能产生其他能降解亚硝酸盐的物质（如NiR等）。另外，本实验也从侧面证实了乳酸菌不能利用亚硝酸盐作为提供其细胞生长所需的氮源或无机盐。有趣的是，笔者在LP9010中发现了推定的亚硝酸盐还原酶基因，例如lmrB和pgl（表6）。此外，植物乳杆菌WCFS1在KEGG途径和NCBI中发现的谷氨酸和谷氨酰胺代谢中显示关键酶。本课题组前期研究表明，LP9010通过电子传输链降解了低浓度的亚硝酸盐（0.276 g/L），部分亚硝酸盐被还原为NH3[21]，但是亚硝酸盐还原酶能否在降解过程中起主导作用仍需进一步研究。

2.7 不同生长因子对LP9010降解亚硝酸盐的影响

由图7，不同生长因子对LP9010的产酸以及亚硝酸盐降解率无明显影响（p＞0.05）（图7a和d）。三组pH（图7a）和酸度（图7b）的变化无明显差异，亚硝酸盐降解率趋势相近，在24 h时均达到100.00%（图7d）。而添加番茄汁12 h后活菌数（3.95×109CFU/mL）会明显高于苹果汁组（5.10×108CFU/mL）和胡萝卜汁组（8.70×108CFU/mL），但24 h时番茄汁组的活菌数会下降到与其他两组相同的水平（7.23×108CFU/mL）（图7c），这与杜磊[22]人的研究结果一致，说明不同生长因子下LP9010产酸无明显差别，亚硝酸盐降解率也相近。在LP9010的全基因组序列中未发现维生素消化和吸收的相关编码基因（KEGG代谢通路为ko04977）。沙吉坦穆·克依斯尔等人从来自传统发酵酸驼乳中筛选出短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）M3-3，探究不同促生长因子（番茄汁、胡萝卜汁、玉米浆）对Levilactobacillus brevisM3-3生长的影响，发现玉米浆对Levilactobacillus brevisM3-3的促生长效果最好[23]，与本研究结果不同，可能是菌株的差异性所导致的。然而不同乳杆菌是否含有维生素消化和吸收的相关编码基因会影响乳杆菌的生长，仍需进一步的研究。

图7 不同生长因子对LP9010降解亚硝酸盐的影响Fig.7 Impact of different growth factors on the nitrite degradation by LP9010

3 结论

本文在不同培养条件和培养基成分条件下培养LP9010，通过研究和分析其pH、酸度、活菌数和亚硝酸盐降解率的变化可知：pH越低时亚硝酸盐降解率越高；37 ℃最有利于LP9010生长繁殖和产酸，从而更好地降解亚硝酸盐，温度升高或者降低使得亚硝酸盐降解率下降；不同培养基成分对LP9010降亚硝酸盐的影响主要体现在增菌作用，活菌数越高，亚硝酸盐降解率越高。通过全基因组分析发现LP9010中有酸耐受，冷热耐受，氧耐受以及糖转运相关的基因，尤其是发现了亚硝酸盐还原酶基因。然而LP9010降解亚硝酸盐深层次的机理仍有待进行转录组和代谢组联合分析验证相关基因与亚硝酸盐降解的相关性。