NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡在大鼠肺泡II型上皮细胞缺氧/复氧损伤中的作用机制研究*

周卓琳， 刘秀洁， 王新雨， 王淑远， 宋正阳， 田云娜，张 赛， 黄丹娜， 王万铁△

（1温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所，浙江温州 325035；2温州市人民医院呼吸内科，浙江温州 325035）

缺血再灌注损伤是器官血流中断引起局部缺血，再灌注后组织损伤进一步加重的现象。近些年，肺缺血再灌注损伤（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）已成为肺移植和心脏搭桥等术后常见而严重的并发症［1］。LIRI 的发病机制十分复杂，且目前尚未完全阐明。因此，深入研究LIRI 的发病机制对于寻找减少组织损伤的新疗法具有重要意义。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体是一种多蛋白复合物，由NLRP3、含caspase 募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和pro-caspase-1 组成，在经典细胞焦亡（pyroptosis）通路中起着重要作用［2］。NLRP3 炎症小体能激活caspase-1，随后，活化的caspase-1 又对gasdermin D（GSDMD）和白细胞介素1β 前体（pro-interleukin-1β，pro-IL-1β）进行切割形成GSDMD-N 和IL-1β，该过程被称为细胞焦亡［3］。适度的细胞焦亡能清除入侵的病原体，维持机体平衡，而过度的细胞焦亡会引起细胞死亡，组织损伤和器官衰竭［4-5］。最近研究表明，NLRP3 炎症小体介导的细胞焦亡，参与了LIRI 的发生发展过程［6］，但其具体机制并不清楚。因此，本实验通过建立大鼠肺泡II 型上皮细胞（type II alveolar epithelia cells，AEC II）缺氧/复氧损伤细胞模型，探讨NLRP3 炎症小体介导的细胞焦亡在大鼠AEC II 缺氧/复氧损伤中的作用及其机制。

材 料 和 方 法

1 实验细胞

大鼠AEC II购于上海富衡生物有限公司。

2 主要试剂和仪器

RPMI-1640 培养液购自Gibico；胎牛血清购自ExCell Bio；LPS 购自Sigma；ATP 和MCC950 购自MedChemExpress；CCK-8 试剂盒购自日本同仁；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒、caspase-1活性检测试剂盒、抗GAPDH、辣根酶标记山羊抗鼠Ⅱ抗、辣根酶标记山羊抗兔Ⅱ抗和Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔Ig G 购于中国碧云天生物技术研究所；抗NLRP3和IL-1β购自Abcam；抗GSDMD抗体购自Santa Cruz Biotechnology；抗NF-κB 抗体购自Cell Signaling Technology；超敏ECL 化学发光试剂盒购自Advansta。

3 主要方法

3.1 细胞培养和实验分组 AEC II 用含12%胎牛血清、1%青、链霉素的RPMI-1640 培养液在37 ℃，5%CO2的培养箱中培养。随机分为4 组：（1）对照（control，Con）组：常氧环境下培养36 h；（2）缺氧/复氧（H/R）组：缺氧培养箱培养6 h 后，复氧培养24 h；（3）NLRP3 炎症小体激动剂（LPS+ATP）组：缺氧前用LPS（100 μg/L）预处理细胞4 h，再用ATP（1 mmol/L）预处理细胞2 h，其余处理同H/R 组；（4）NLRP3 炎症小体抑制剂（MCC950）组：缺氧前用MCC950（10 μmol/L）预处理细胞2 h，其余处理同H/R组。

3.2 H/R 损伤模型的建立 在本实验室前期研究基础上，构建大鼠AEC II的H/R模型［7］。AEC II弃去旧培养液，加入经高纯氮气饱和处理过的无糖无血清培养液作为缺氧液。放入提前设置好参数（1%O2，94%N2，5%CO2，37 ℃）的三气培养箱缺氧孵育6 h。缺氧处理结束后，将缺氧液更换为无血清的RPMI-1640 培养液，置于常氧培养箱中（95% O2，5%CO2，37 ℃）复氧孵育24 h。

3.3 CCK-8 细胞活力和LDH 活性测定 细胞处理结束后，根据说明书每孔加入110 μL 的CCK-8 混合液（CCK8∶RPMI-1640 培养液=1∶10），放入常氧培养箱孵育0.5～2 h，置酶标仪于波长450 nm处的吸光度（A）值。培养液LDH 含量测定，收集各组细胞上清液按照试剂盒说明书操作。

3.4 caspase-1 活性测定 细胞处理结束后，提取各组细胞蛋白，蛋白定量，根据caspase-1活性检测试剂盒说明书加入试剂盒内的试剂，置多功能酶标仪于波长405 nm 处的A值。caspase-1 活性（%）=实验处理组A值/实验对照组A值×100%。

3.5 Western blot 法检测细胞焦亡相关蛋白水平细胞处理结束后，每皿加入RIPA 裂解液（1∶100）500 μL，提取各组细胞蛋白。蛋白定量，凝胶电泳，电转印至PVDF 膜（湿转），5%脱脂牛奶封闭，用兔抗NFκB、NLRP3、IL-1β 和GAPDH 抗体，以及鼠抗GSDMD抗体4 ℃摇床孵育过夜，TBST 洗膜4 次，辣根过氧化物酶标记相应Ⅱ抗孵育1 h。免疫条带ECL 法显示，利用荧光化学发光成像系统进行图像采集，采用Image Lab软件分析条带。

3.6 免疫荧光细胞化学法检测NF-κB 和caspase-1表达水平 将AEC II 接种在6 孔板的细胞爬片上，4%的多聚甲醛固定细胞，0.5% Triton X-100 通透，5%牛蛋白血清（BSA）封闭之后滴加抗NF-κB 和caspase-1 抗体，湿盒4 ℃过夜。次日PBS 洗涤3 次滴加稀释好的Ⅱ抗，湿盒室内孵育1 h（此后都在暗室操作），PBS 洗涤3次滴加含有DAPI的抗荧光淬灭剂封片液封片，置于正置荧光显微镜下采集图像。采用ImageJ软件进行分析。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析。所有的计量资料均以均数±标准差（Mean±SD）表示。多组样本间的比较应用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用LSD 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 NLRP3 炎症小体抑制剂MCC950 对缺氧/复氧引起的AEC II损伤的影响

与Con 组相比，H/R、LPS+ATP 和MCC950 三组的细胞活力显著下降（P＜0.05），LDH 释放显著增加（P＜0.05）；与H/R 组相比，LPS+ATP 组的细胞活力显著下降（P＜0.05），LDH 释放显著增加（P＜0.05），MCC950 组的细胞活力显著升高（P＜0.05），LDH 释放显著减少（P＜0.05），见图1。

Figure 1. Effects of NLRP3 inflammasome inhibitor MCC950 on the AEC II injury induced by hypoxia/reoxygenation（H/R）. A：the viability of AEC II detected by CCK-8 assay；B：the release level of LDH. Mean±SD.n=3.**P＜0.05vs control（Con）group；##P＜0.05vs H/R group.图1 NLRP3炎症小体抑制剂MCC950对缺氧/复氧引起的AEC II损伤的影响

2 NLRP3 炎症小体抑制剂MCC950 对缺氧/复氧诱导的AEC II中NF-κB和caspase-1表达的影响

与Con 组相比，H/R、LPS+ATP 和MCC950 组细胞中NF-κB 和caspase-1 免疫荧光表达显著增多（P＜0.05）；与H/R 组相比，LPS+ATP 组细胞中NF-κB 和caspase-1免疫荧光表达显著增加（P＜0.05），MCC950组细胞中NF-κB和caspase-1免疫荧光表达显著减少（P＜0.05），见图2。

Figure 2. Effects of NLRP3 inflammasome inhibitor MCC950 on the expression of NF-κB（A）and caspase-1（B）in the AEC II induced by hypoxia/reoxygenation（H/R）. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.**P＜0.05vs control（Con）group；##P＜0.05vs H/R group.图2 NLRP3炎症小体抑制剂MCC950对缺氧/复氧诱导的AEC II中NF-κB和caspase-1荧光表达的影响

3 NLRP3 炎症小体抑制剂MCC950 对缺氧/复氧诱导的AEC II中caspase-1活性的影响

与Con 组相比，H/R、LPS+ATP 和MCC950 组的caspase-1 活性显著上升（P＜0.05）；与H/R 组相比，LPS+ATP 组细胞caspase-1 活性显著上升（P＜0.05），MCC950 组细胞caspase-1 活性显著下降（P＜0.05），见图3。

Figure 3. The effect of NLRP3 inflammasome inhibitor MCC950 on the activity of caspase-1 in the AEC II induced by hypoxia/reoxygenation（H/R）. Mean±SD.n=3.**P＜0.05vs control（Con）group；##P＜0.05vs H/R group.图3 NLRP3 炎症小体抑制剂MCC950 对缺氧/复氧诱导的AEC II中caspase-1活性的影响

4 NLRP3 炎症小体抑制剂MCC950 对缺氧/复氧诱导的AEC II细胞焦亡相关蛋白水平的影响

Western blot检测结果显示，与Con组相比，H/R、LPS+ATP和MCC950组的NLRP3、GSDMD-N和IL-1β的蛋白表达显著增加（P＜0.05）；与H/R组相比，LPS+ATP 组的NLRP3、GSDMD-N 和IL-1β 的蛋白表达显著增加（P＜0.05），MCC950 组的NLRP3、GSDMD-N和IL-1β的蛋白表达显著下降（P＜0.05），见图4。

Figure 4. Effects of NLRP3 inflammasome inhibitor MCC950 on the protein expression levels of NLRP3（A），GSDMD-N（B），IL-1β（C）and NF-κB（D）in the AEC II induced by hypoxia/reoxygenation（H/R）. Mean±SD.n=3.**P＜0.05vs control（Con）group；##P＜0.05vs H/R group.图4 NLRP3炎症小体抑制剂MCC950对缺氧/复氧诱导的AEC II中NLRP3、GSDMD-N、IL-1β和NF-κB蛋白表达的影响

讨论

肺缺血/再灌注损伤表现为血管通透性增加，肺水肿，炎症反应。当机体遭受缺血/再灌注（缺氧/复氧）等应激条件时，肺组织的主要效应细胞AEC II会发生损伤性改变，影响肺泡表面活性物质的功能，引起细胞功能紊乱，加重肺组织的损伤［8］。本实验结果显示，与Con组相比，H/R 组的细胞活力显著下降，LDH 含量增加，AEC II 损伤加重，提示H/R 细胞损伤模型成功。

在焦亡信号通路中，NLRP3 通过ASC 与pro-caspase-1 连接形成NLRP3 炎症小体激活casapse-1。生理情况下，caspase-1 以酶原的形式存在。被炎症小体激活后，形成活化的caspase-1。活化的caspase-1切割pro-IL-1β 形成成熟的IL-1β，引起炎症反应。GSDMD-N 是炎症小体活化后诱导细胞焦亡的可靠标志［9］。GSDMD 作为细胞焦亡唯一的底物，经上游活化的casapse-1 切割后形成具有穿孔作用的GSDMD-N 端，致使细胞肿胀、细胞膜溶解，释放细胞内的IL-1β 到细胞外，加大炎症反应，进一步诱导细胞焦亡［10-11］。本研究显示，离体AEC II 细胞经缺氧/复氧、NLRP3 炎症小体激动剂-LPS+ATP 处理后，细胞焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD-N 和IL-1β 水平增加，caspase-1 活力增加和荧光表达增强，初步证实了NLRP3 炎症小体介导的细胞焦亡参与了H/R 引起的AEC II损伤。本研究中预先采用NLRP3炎性小体抑制剂MCC950 处理后，上述焦亡通路中的相关蛋白表达水平均出现下调，表明NLRP3炎症小体抑制剂-MCC950对H/R引起的AEC II损伤具有干预作用。

NF-κB 被认为是控制缺血/再灌注（缺氧/复氧）损伤过程中促炎基因表达的关键转录因子。当发生缺血再灌注（缺氧/复氧）时，NF-κB 激活的促炎因子基因，释放大量促炎因子，进一步加重组织、细胞及器官损伤［12］。研究表明NF-κB作为NLRP3炎性小体的“起始”信号，在NLRP3炎症小体的活化中，发挥着重要的作用［13］。Kuang等［14］表明，NLRP3沉默通过减少NF-κB 抑制剂降解而降低肺纤维化中胶原蛋白合成。另外，Wang 等［15］表明，在非酒精性脂肪肝，NLRP3 炎性小体抑制剂-MCC950 通过抑制NLRP3 炎症小体减少NF-κB 的激活，降低肝脏炎症反应。这些研究表明NF-κB 和NLRP3 炎症小体相互之间有上下游的关系。本实验显示，NLRP3 炎症小体抑制剂-MCC950 可使NF-κB 表达减少，改善细胞焦亡，减轻H/R 引起的AEC II 损伤，其潜在机制可能与其抑制NF-κB有关。

综上所述，H/R 可激活NF-κB 和NLRP3 炎症小体，上调细胞焦亡相关信号传导，加重AEC II 损伤；应用NLRP3 炎症小体抑制剂MCC950 可抑制H/R 引起的AEC II 损伤，其潜在机制可能与其抑制NF-κB有关。本研究采用离体大鼠AEC II，探讨了NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡在大鼠AEC II 缺氧/复氧损伤中的作用机制，但仍需进一步从整体动物实验中得到证实。