青钱柳多糖和青钱柳黄酮对非酒精性脂肪性肝病合并2型糖尿病模型大鼠血液代谢指标及肝脏病变的影响*

彭晓娟， 钟 绿， 吴楚添， 龙 亮， 李 庆，4， 汤绍辉△

（1湘南学院附属医院，湖南郴州 423000；2柳州市人民医院，广西柳州 545006；3暨南大学附属第一医院，广东广州 510630；4医学影像人工智能湖南省重点实验室，湖南郴州 423000）

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）和2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）在21世纪的全球流行是对人类健康的主要挑战之一。NAFLD目前被公认为世界上最常见的慢性肝病，在一般人群中发病率高达30%［1］。NAFLD 包括一系列疾病谱，从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH），乃至肝硬化和肝细胞癌［2］。肥胖、高脂血症、糖尿病、代谢综合征和胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）被公认为NAFLD 的危险因素［3-4］。T2DM是一种复杂的代谢紊乱，其特点为高血糖、低度炎症、胰岛素抵抗和胰岛B 细胞分泌不足，主要影响血糖、脂质和蛋白质代谢［5-6］。NAFLD 和T2DM 有共同的危险因素，如肥胖和IR。近年来，NAFLD 在T2DM人群中的发病率逐年上升，且显著高于未合并T2DM人群［7-8］。值得注意的是，NAFLD 合并T2DM 对健康的危害更大，更容易引起心血管疾病、慢性肾脏病和癌症等［3，9］。

目前，对于NAFLD 的治疗仍以运动、减重和控制饮食为主，尚无针对NAFLD 的特效药物［10］。临床上已有多种治疗T2DM 的药物，尽管这些药物能够有效减轻糖尿病症状，但存在一定的副作用，如肝肾功能损害、胃肠道反应等［11］。目前尚缺乏有效的兼顾治疗NAFLD合并T2DM的药物。

青钱柳（Cyclocarya paliurus）生长于中国南方的山区中，具有食用及药物价值。青钱柳叶作为一种传统中药，在预防及治疗糖尿病、高血压及高脂血症方面有着悠久的历史［12］。青钱柳叶含有多种具有生物活性的化学成分，如多糖、黄酮、香豆素、类固醇、三萜等［13］。青钱柳多糖（Cyclocarya paliuruspolysaccharides，CPP）和青钱柳黄酮（Cyclocarya paliurusflavonoids，CPF）作为青钱柳叶的主要活性成分，已在动物实验中被观察到具有抗炎、降脂、降糖、抗氧化及调节免疫功能等功效［14-17］。然而，目前尚缺乏关于CPP 和CPF 对NAFLD 合并T2DM 大鼠模型血糖、血脂及肝脏病变影响的研究。因此，本项工作应用NAFLD 合并T2DM 大鼠模型对上述问题进行探讨，为临床上青钱柳用于治疗NAFLD 合并T2DM 患者提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 CPP和CPF的制备

青钱柳叶采购于湖南省郴州市明润生物制品有限公司。

CPP 的制备按照Xie 等［18］的方法进行，简要步骤如下：将青钱柳叶干燥并粉碎后用95%乙醇浸泡12 h，然后过滤；将滤渣在空气中干燥后置于95 ℃下用蒸馏水煮2 h（1 mg∶20 mL），重复以上操作2 次。对得到的混合物进行过滤，保留滤液。将滤液在60 ℃下旋转蒸发浓缩，然后于80%乙醇中放置过夜。将获得的CPP 中的蛋白用Savag 法去除，并于-40 ℃真空下干燥。最后，应用苯酚-硫酸法测定CPP 含量，为79.6%［15］。

CPF 的制备按照Cheng等［19］的方法进行，简要步骤如下：青钱柳叶粉碎后用95 ℃的蒸馏水提取40 min，提取物在4 500×g下离心15 min，重复以上操作2 次。将上清液混合，并用旋转蒸发器浓缩，残留物用去离子水溶解，用0.45 μm 微滤膜过滤，然后置于AB-8 树脂柱上（30 cm×1.6 cm）；收集流出液并进行浓缩，得到CPF 的提取物。最终，应用氯化铝法测定CPF含量，为84.3%［20］。

2 主要试剂

格列吡嗪（glipizide）缓释片购自辉瑞制药有限公司；戊巴比妥钠购自北京市华业寰宇化工有限公司；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）粉剂购自Sigma；柠檬酸钠缓冲液购自美国赛默飞世尔中国分公司；福尔马林购自山东省醛业化工有限公司；苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色试剂盒购自上海市碧云天生物科技有限公司；空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、γ-谷氨酰转移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、血清低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、大鼠白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和大鼠肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒均采购于南京建成生物工程研究所；大鼠胰岛素检测试剂盒购自R＆amp;D。

3 动物模型制备

SPF级6周龄雄性SD大鼠共60只，体质量（180±20）g，购自广东省医学实验动物中心。动物实验开始前，所有大鼠均在（24±2）℃、（55±10）%相对湿度、12 h 明暗周期条件下适应性喂养10 d。本研究符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则，经暨南大学实验动物伦理委员会批准进行实验。

经适应性喂养后，60 只大鼠随机分为正常对照（normal control，NC）组（n=10）和NAFLD 合并T2DM模型（NAFLD/T2DM）组（n=50）。NAFLD/T2DM 组大鼠喂饲高脂饲料［high-fat diet，HFD；含有34%脂肪、2%胆固醇、26%碳水化合物、26%蛋白质和12%基础饲料（均为质量分数）］8 周，接着腹腔注射STZ（25 mg/kg）［21］。此后，连续10 d 监测FBG，均≥11 mmol/L者被认为NAFLD/T2DM 造模成功。NC 组大鼠以标准的实验室饮食喂养8周，接着注射与STZ溶液等体积的柠檬酸盐缓冲液。本实验中，成功建立48 只NAFLD/T2DM大鼠。实验流程见图1。

Figure 1. Experimental design of the study. HFD：high-fat diet；STZ：streptozotocin；NC：normal control；NAFLD/T2DM：NAFLD complicated with T2DM；CPP：Cyclocarya paliurus polysaccharides；CPF：Cyclocarya paliurus flavonoids.图1 实验流程图

4 实验分组及处理

将48 只NAFLD/T2DM 大鼠随机分为NAFLD/T2DM 组（n=12）、CPP 组（n=12）、CPF 组（n=12）和glipizide 组（n=12），并继续给予HFD。根据Wang等［16］的实验剂量进行适当调整，NAFLD/T2DM 组、CPP 组、CPF 组和glipizide 组分别每天给予蒸馏水、CPP（8 g·kg-1·d-1）、CPF（6 g·kg-1·d-1）和glipizide（2.5 mg·kg-1·d-1）灌胃处理，共12 周；而NC 组则给予标准实验饲料喂养12周。

5 检测指标

5.1 大鼠一般情况及体质量监测 在实验期间每周测量大鼠体质量并仔细观察大鼠精神状态、体力活动、皮毛情况、摄水量、摄食量、尿量及生存情况。

5.2 血代谢指标检测 实验结束后，所有大鼠均禁食1 晚，第2 天用1%戊巴比妥溶液（40 mg/kg）麻醉，采集腹主动脉血样，使用商用检测试剂盒，根据试剂盒说明书操作，对FBG、ALT、AST、GGT、TC、TG、LDL-C、IL-6、TNF-α 及空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）各项指标进行检测。同时，计算稳态模型评估胰岛素抵抗指数（homeostatic model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）：HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。

5.3 肝脏组织学观察及NAFLD 活动度评分（NAFLD activity score，NAS） 实验结束后处死大鼠，称量大鼠肝质量（liver mass）并计算肝质量指数（liver mass index）=肝质量/体质量×100%。肝脏组织标本在10%福尔马林中性缓冲液中浸泡48 h，常规处理，石蜡包埋，切成5 μm 薄片，用苏木精溶液和伊红染液染色，最后脱水封片。待切片干燥后在光学显微镜下观察组织的病理表现，采用Image-Pro Plus 6.0 软件进行脂肪定量分析［22］。NAS 的评价标准见表1［23-24］。

表1 NAFLD活动度评分标准Table 1. The evaluation standard of NAFLD activity score（NAS）

6 统计学处理

统计分析均在SPSS 21.0 软件中执行。所有数据均用中位数（下四分位数，上四分位数）及均数±标准差（mean±SD）表示。定量资料采用独立样本t检验或单因素方差分析，再采用Mann-WhitneyU检验或Kruskal-WallisH检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 CPP 和CPF 对NAFLD/T2DM 大鼠一般状况及体质量的影响

在实验期间，共有12 只大鼠因死亡而退出实验（NC 组1 只，NAFLD/T2DM 组2 只，CPP 组3 只，CPF组3 只，glipizide 组3 只）。与NC 组相比，NAFLD/T2DM 组大鼠反应迟钝、行动迟缓、烦躁不安、多饮、多食、多尿；CPP 组、CPF 组和glipizide 组大鼠一般状况较NAFLD/T2DM 组大鼠显著改善。与NC组相比，NAFLD/T2DM 组大鼠体质量显著降低（P＜0.01）；与NAFLD/T2DM 组相比，CPP 组、CPF 组和glipizide 组大鼠体质量均显著增加（P＜0.05），见表2。

2 CPP 和CPF 对NAFLD/T2DM 大鼠肝功能和血脂水平的影响

与NC 组相比，NAFLD/T2DM 组大鼠肝酶（ALT、AST和GGT）及血脂（TC、TG和LDL-C）水平均显著升高（P＜0.01）；与NAFLD/T2DM 组相比，CPP 组和CPF组大鼠肝酶（ALT、AST 和GGT）及血脂（TC、TG 和LDL-C）水平均显著下降（P＜0.05 或P＜0.01），而glipizide 组大鼠肝酶无显著变化，但TG 水平显著下降（P＜0.01），见表2、图2。

Figure 2. Comparison of biochemical results in each group. Mean±SD.n=9.*P＜0.05，**P＜0.01vs NC group；#P＜0.05，##P＜0.01vs NAFLD+T2DM group.图2 各组生化结果比较

表2 各组大鼠体质量及生化结果的比较Table 2. Comparison of body mass and biochemical results in each group

3 CPP 和CPF 对NAFLD/T2DM 大鼠炎症因子及糖代谢指标的影响

与NC 组相比，NAFLD/T2DM 组大鼠炎症因子（TNF-α 和IL-6）及糖代谢指标（FBG、FINS 和HOMAIR）水平均显著升高（P＜0.01）；与NAFLD/T2DM 组相比，CPP 组、CPF 组和glipizide 组大鼠炎症因子（TNF-α 和IL-6）及糖代谢指标（FBG、FINS 和HOMAIR）水平均显著下降（P＜0.01），见表3、图3。

Figure 3. Comparison of glucose metabolism indexes and proinflammatory cytokines in each group. Mean±SD.n=9.**P＜0.01vs NC group；##P＜0.01vs NAFLD+T2DM group.图3 各组糖代谢指标及炎症因子的比较

表3 各组大鼠糖代谢指标及炎症因子的比较Table 3. Comparison of glucose metabolism indexes and proinflammatory cytokines in each group

4 CPP 和CPF 对NAFLD/T2DM 肝脏病理变化的影响

与NC 组相比，NAFLD/T2DM 组大鼠肝质量及肝质量指数均显著升高（P＜0.01）；与NAFLD/T2DM 组相比，CPP 组和CPF 组大鼠肝质量及肝质量指数均显著下降（P＜0.01），而glipizide 组大鼠肝质量无明显变化，但肝质量指数显著下降（P＜0.01），见表4、图4。

肝组织脂肪含量半定量分析结果显示，与NC 组相比，NAFLD/T2DM 组大鼠肝组织脂肪变性细胞比例显著升高（P＜0.01）；与NAFLD/T2DM 组相比，CPP组和CPF 组大鼠肝组织脂肪变性细胞比例均显著下降（P＜0.01），而glipizide 组大鼠肝组织脂肪变性细胞比例无显著变化，见表4、图5。

Figure 5. Hepatic pathological changes. A：from the HE stained sections of the liver，hepatocytes in NC group were observed to be arranged neatly with normal appearance，while diffuse hepatocellular degeneration with huge lipid vacuoles was seen in NAFLD/T2DM group. Both CPP and CPF intervention significantly decreased the above hepatic pathological features. The scale bar=20 μm. B：effects of CPP and CPF on liver fat content. The data in box plot were expressed as median（Q1，Q3）.n=9.*P＜0.01vs NC group；##P＜0.01vs NAFLD/T2DM group.图5 肝脏病理学变化

NAFLD/T2DM 组大鼠NAS 显著高于NC 组（P＜0.01）；与NAFLD/T2DM 组相比，CPP 组和CPF 组大鼠NAS 显著降低（P＜0.01），而glipizide 组大鼠则无显著变化，见表4、图4。

Figure 4. Comparison of hepatic pathological indexes in each group. Mean±SD.n=9.**P＜0.01vs NC group；##P＜0.01vs NAFLD+T2DM group.图4 各组肝脏病理学指标的比较

表4 各组大鼠肝脏病理学指标的比较Table 4. Comparison of hepatic pathological indexes in each group

讨论

青钱柳为我国特有的单种属珍稀药食同源植物，可用于心血管疾病、糖尿病等慢性病的防治。青钱柳含有多种活性成分，主要包括多糖、黄酮、三萜等，具有抗炎、降血糖及降血脂等功效。Lin 等［25］的研究显示，青钱柳氯仿提取物显著减轻HFD 诱导的大鼠肝脏脂肪变性程度；Yao 等［21］报道，CPP 显著改善T2DM 模型大鼠糖尿病表现及糖代谢指标。青钱柳改善代谢疾病的机制尚未完全明确，可能涉及多个方面。研究显示，CPP 和CPF 对羟基自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基有显著的清除效果，明显提高超氧化物歧化酶活性，减少丙二醛含量，增加抗氧化能力，从而对肝损伤模型小鼠起到保护肝脏的作用［26-29］；青钱柳氯仿提取物显著降低血清非酯化脂肪酸水平，减少肝脏脂质从头合成（de novolipogenesis，DNL），从而抑制NAFLD 大鼠模型肝脏脂肪变性［24］；CPP 和CPF 显著抑制糖尿病模型小鼠小肠黏膜中的二糖降解酶α-葡萄糖苷酶活性，使葡萄糖吸收减少，进而降低血糖水平［30-32］；张小芳等［33］及许光远等［34］的研究显示，CPP 可通过清除糖尿病模型小鼠体内H2O2和Fe2+等自由基和抗脂质过氧化起到保护胰岛细胞作用，并且增强胰岛素信号通路关键靶

点胰岛素受体和胰岛素受体底物2 的表达，发挥降低血糖作用。

但是，目前尚未见有关报道CPP 和CPF 对NAFLD 合并T2DM 大鼠模型血糖、血脂及肝脏病变影响的实验研究。鉴于此，本研究通过HFD 结合STZ诱导构建NAFLD/T2DM大鼠模型，观察给予CPP和CPF 处理后NAFLD/T2DM 大鼠的一般情况、血液代谢指标及肝脏组织病理学变化。我们的结果表明，CPP 和CPF 对NAFLD/T2DM 大鼠代谢紊乱及肝脏病理改变的治疗效果显著优于glipizide。本研究结果与已发表的相关文献结果相似［26，33，35-36］。

总之，本研究探讨了CPP 和CPF 对NAFLD/T2DM 模型大鼠代谢异常及肝脏病理改变影响的实验研究，研究结果对于临床上CP 及其活性成分CPP和CPF 用于治疗NAFLD 合并T2DM 患者提供了参考资料。