线粒体功能障碍在细胞衰老中作用的研究进展*

朱梦琪， 闵赛南， 吴立玲， 俞光岩， 丛 馨△

（1北京大学口腔医学院口腔颌面外科，北京100081；2北京大学基础医学院生理学与病理生理学系，北京100191）

细胞衰老（cellular senescence）是指细胞不可逆性丧失复制能力，细胞周期阻滞于G0/G1期，但细胞仍保持一定的代谢活性。衰老细胞的累积会导致器官功能障碍，与多种衰老相关性疾病（aging-related disease，ARD）的发生发展密切相关，如特发性肺纤维化［1］、动脉粥样硬化［2］、阿尔茨海默病［3］等，严重影响患者的生活质量。因此，深入认识细胞衰老的发生原因和分子机制对于早期干预及治疗ARD 具有重要意义。线粒体是细胞的“能量工厂”，线粒体功能障碍亦是引起细胞衰老的重要原因。传统的观点认为线粒体功能紊乱主要通过氧化应激导致细胞周期阻滞，包括线粒体来源的活性氧（reactive oxygen species，ROS）对线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）、线粒体膜和端粒的损伤作用等，从而造成细胞衰老。近年来的研究发现，以线粒体动力学、能量代谢和质量控制等异常为特征的线粒体稳态调控失常在细胞衰老中发挥重要作用。本文旨在综述线粒体功能障碍在细胞衰老中的作用及机制研究的新进展，为以线粒体为靶点防治细胞衰老提供新思路。

1 概述

细胞衰老可分为复制性衰老（replicative senescence，RS）和应激诱导性早衰（stress-induced premature senescence，SIPS）两大类：前者是指细胞经过有限的分裂次数后染色体末端的端粒逐渐缩短，由此出现的细胞增殖停滞和分化能力丧失等衰老特征；后者是指在癌基因激活、DNA 损伤和氧化应激等病理刺激下，细胞发生的过早衰老。早期的研究认为，SIPS 的发生独立于端粒状态，然而越来越多的证据表明它同样可与端粒的缩短和功能障碍有关［4-5］。这2种类型的衰老有许多共同的调控分子，如均主要通过p53/p21 和（或）p16/视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）蛋白信号通路引起细胞周期阻滞［6］。细胞发生衰老后可伴随一系列的表型改变，包括在形态上变得扁平、体积增大，在蛋白表达调控上表现为细胞周期蛋白激酶抑制分子如p53、p21 和p16 等表达增加以及衰老相关β-半乳糖苷酶活性增强等；衰老细胞还表现出一定的抗凋亡特性，这可能是衰老细胞失去增殖能力后却能长期存活的重要原因。此外，衰老细胞的一个重要特征是发生衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）转化，继而分泌更多的促炎因子、生长因子和趋化因子等，以自分泌和旁分泌的方式引起局部炎症反应，进一步加速其邻近细胞的衰老。

线粒体是一种广泛存在于真核细胞中的细胞器，不仅可通过氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）产生ATP，为细胞提供能量，还在细胞分化、信息传递和凋亡等过程中发挥重要作用［7］。线粒体稳态是机体维持线粒体和细胞正常功能的重要机制，主要包括线粒体动力学（mitochondrial dynamics）、线粒体生物生成（mitochondrial biogenesis）和线粒体自噬（mitophagy）等调控过程。近年来研究报道，由线粒体稳态失衡所致的形态和功能异常的线粒体可见于多种衰老细胞中，而通过诱导线粒体自噬来清除受损线粒体可有效缓解细胞衰老的发生，这提示线粒体形态和功能异常可能参与了细胞衰老的发生发展。

2 衰老细胞中线粒体形态的改变

线粒体的结构由内向外可划分为基质、内膜、膜间隙和外膜4个部分。其中，线粒体内膜向内皱褶形成管状或片状的内陷，称为线粒体嵴，嵴上含有大量ATP 合酶，与调控线粒体呼吸功能关系密切。另外，线粒体的形态呈现一定程度的组织特异性，如在肝细胞中呈球形或卵圆形，而在成纤维细胞中通常是长丝状［8］。衰老细胞的线粒体结构和形态会发生异常改变：在发生RS 的人成纤维细胞诱导的多能干细胞中观察到线粒体嵴断裂［9］；在慢性阻塞性肺疾病患者衰老的支气管上皮细胞中存在线粒体肿胀和分裂现象，且碎片化程度显著高于正常细胞［10］；在去铁胺诱导的人衰老肝细胞中发现线粒体肿胀和长度增加［11］；在替莫唑胺诱导的小鼠衰老黑色素瘤细胞中堆积着细长的管状线粒体，其长度较正常短圆形线粒体显著增加［12］。此外，线粒体在衰老细胞中的分布也会发生改变：线粒体在正常猪卵母细胞中均匀分布于细胞浆中，而在体外培养的RS 细胞中则成簇地聚集于细胞浆或胞膜内侧［13］。上述研究表明，衰老细胞中存在结构、形态和分布异常的线粒体，它们是否参与细胞衰老的发生也是目前研究的关注点。

3 细胞衰老与线粒体动力学改变

线粒体是一种动态变化的细胞器，在细胞内形成相互连接的网络并沿着细胞骨架运动，通过不断融合和分裂来改变自身形态，以适应细胞对能量需求的变化，这一过程称为线粒体动力学。在哺乳动物中，研究较多的调控融合的蛋白是线粒体融合蛋白1/2（mitofusion 1/2，MFN1/2）和视神经萎缩症蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）［14］。MFN1/2 是位于线粒体外膜的跨膜蛋白，参与调控线粒体外膜的融合；OPA1表达于线粒体膜间隙内，不仅可以介导内膜的融合，还能够维持线粒体嵴结构和内膜的完整性。调控线粒体分裂的主要分子包括发动蛋白相关蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）、线粒体分裂因子（mitochondrial fission factor，MFF）和线粒体分裂蛋白1（mitochondrial fission protein 1，FIS1）［15］。其中，DRP1主要表达在胞浆。在受到特定刺激后，位于线粒体表面的MFF和FIS1可招募DRP1至线粒体周围，聚集的DRP1呈螺旋环状包绕线粒体并形成裂变点，从而将线粒体受损部分与正常部分分离，并通过线粒体自噬清除受损部分以维持线粒体的正常功能［16-17］。

正常情况下，线粒体的融合和分裂处于动态平衡状态，一旦被打破，线粒体形态可发生改变并进一步导致功能障碍。在发生RS 的人骨髓间充质干细胞中存在线粒体融合增加及分裂减少的现象［18］。在人肝细胞中敲减膜相关锌指蛋白5 可减少DRP1 的表达，增加MFN1 的表达，引起线粒体融合和长度增加，从而导致细胞发生衰老［19］。在敲减FIS1的人肝细胞中可见线粒体长度增加、细胞变大变平、衰老相关β-半乳糖苷酶活性升高和细胞增殖能力显著降低等细胞衰老特征［20］。在人肺癌细胞中过表达p53 蛋白能够增加DRP1 第637 位丝氨酸的磷酸化，抑制DRP1 向线粒体移动，引起线粒体变长及功能障碍，从而导致细胞衰老［21］。上述研究提示，线粒体的过度融合是导致细胞衰老的一个重要原因。通常认为，融合能够增加ATP 的生成，是线粒体对细胞能量需求增加和线粒体生物生成减少的应对措施［22］，也有观点认为线粒体融合会导致ROS增加及线粒体呼吸功能降低［11］，但其具体机制仍需进一步探究。

此外，线粒体的过度分裂也可导致细胞衰老。有研究发现，蛋白质二硫化异构酶A1 的低表达可诱导DRP1 发生亚磺酰化，引起线粒体分裂，从而导致人脐静脉内皮细胞发生衰老［23］。在人血管平滑肌细胞中，敲减转录因子Krüppel 样因子5 可降低真核细胞翻译起始因子5a 的表达，引起线粒体过度分裂和ROS 产生，导致细胞衰老［24］。然而，也有观点认为线粒体异常分裂只是细胞衰老的结果。

以上研究表明，线粒体动力学的变化将导致线粒体的形态改变和功能障碍，从而造成细胞衰老。其中，线粒体的过度融合导致细胞衰老的现象较为明确，而线粒体的过度分裂与细胞衰老的因果关系仍需进一步研究。

4 线粒体能量代谢对细胞衰老的影响

线粒体能量代谢异常与细胞衰老的发生密切相关［25-26］。正常情况下，细胞内绝大部分的ATP由线粒体内膜上的OXPHOS 产生，这一过程需要由呼吸链复合物I～IV 构成的电子传递链和ATP 合酶的参与［27-28］。线粒体氧化损伤和mtDNA 突变等因素可通过损伤呼吸链复合物引起线粒体能量代谢障碍，导致细胞衰老。有学者检测了中青年（29～62 岁）及老年（65～83 岁）心肌细胞OXPHOS 相关分子表达及活性的变化，发现老年组有10%的线粒体蛋白编码基因表达发生显著变化，其中49%与线粒体能量代谢相关，提示线粒体能量代谢的改变可能与人心肌细胞的衰老有关［29］。在衰老的人成纤维细胞中，线粒体OXPHOS 相关基因表达下降，且伴有明显的线粒体功能障碍，通过诱导线粒体自噬以清除受损线粒体的方法可有效地减少衰老细胞发生SASP 转化［30］。线粒体电子传递链抑制剂鱼藤酮可通过抑制呼吸链复合物I 的活性，诱导年轻小鼠肝细胞发生衰老［31］。最近，有研究发现抑制呼吸链复合物I活性可导致人成纤维细胞线粒体功能障碍，并引起一种特殊类型的细胞衰老，称为线粒体功能障碍相关性衰老（mitochondrial dysfunction-associated senescence，MiDAS）。与相同细胞类型的RS 相比，MiDAS 细胞表现为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）值降低、AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）和p53 蛋白磷酸化以及SASP相关因子如IL-1 的表达明显减少［32］。在体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞中，C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白9 能够激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ 辅激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α，PGC-1α）/AMPK 信号通路，增强细胞的抗氧化能力；而沉默PGC-1α或AMPK基因会造成细胞内ROS 水平升高，引起线粒体呼吸能力下降，ATP 生成减少，进而导致细胞衰老［33］。以上研究提示，呼吸链功能损伤引起的线粒体能量代谢障碍是细胞衰老的重要原因。

此外，呼吸链复合物I 可将NADH 氧化为NAD+，NAD+作为传递电子的辅酶在ATP 合成过程中发挥重要的作用。近年来，越来越多的研究证实NAD+在抑制细胞和机体衰老过程中亦发挥重要作用。在小鼠视网膜色素细胞中，NAD+的表达水平与年龄呈负相关［34］。有学者分析了15 位青年人［（29±4）岁］和15位老年人［（81±7）岁］的血液代谢物，发现NAD+的表达水平随年龄的增长而降低［35］。进一步探究其机制，NAD+表达水平的降低可减少超氧化物歧化酶的表达，进而增加细胞内ROS的水平，从而诱导体外培养的大鼠心肌细胞发生衰老［36］。此外，NAD+表达水平的下降可抑制NAD+依赖性蛋白——沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的活性，促进人成纤维细胞的衰老，而上调NAD+的表达水平可显著抑制细胞衰老［37］。此外，在衰老的人胚肺成纤维细胞中，NAD+可通过增强NF-κB 的活性，上调SASP 相关分子IL-1β、IL-6 和IL-8 的表达，从而促进肿瘤细胞增殖，提示尽管NAD+具有一定的抗衰老作用，但对于肿瘤患者给予含NAD+的抗衰老饮食时仍应控制剂量［38］。以上结果表明，线粒体能量代谢异常可导致细胞衰老；更加全面地了解NAD+的抗衰老和其他副作用，将是后续研究的重点。

5 线粒体质量控制对细胞衰老的影响

线粒体质量控制是维持线粒体功能的一个重要因素，主要包括线粒体生物生成和受损线粒体的生物降解。线粒体的生物生成包括严格调控的转录、mtDNA 复制、脂质和蛋白质的合成和组装等过程［39］。PGC-1α 是目前研究较多的一个调控线粒体生物生成的重要分子，主要分布于心肌、骨骼肌等能量需求较高的组织中。PGC-1α通过诱导核呼吸因子1的表达激活线粒体转录因子A 以促进mtDNA 的转录，从而增加线粒体生物生成，若PGC-1α 表达水平降低则可导致线粒体生物合成障碍［40-41］。在端粒功能障碍的小鼠中，活化的p53 可降低PGC-1α/β 表达，抑制mtDNA 转录，减少线粒体生物生成，最终引起心肌和肝细胞衰老［42］。此外，敲减小鼠胚胎成纤维细胞中PGC-1α 的表达，还可引起线粒体ROS 水平增加，导致细胞衰老的发生［43］。血管内皮细胞衰老是许多衰老相关心血管疾病如高血压和动脉粥样硬化的发病原因。有研究发现，敲减CR6 相互作用因子1 可促进核因子E2 相关因子2 和PGC-1α 降解，下调SIRT3的表达，导致血管内皮细胞发生衰老［44］。除了表达水平的变化，PGC-1α 表观遗传的修饰变化如乙酰化水平也会诱导细胞衰老。有研究发现，大鼠衰老心肌细胞中线粒体基质密度降低，线粒体嵴紊乱，内膜损伤；腹腔注射亚精胺可通过上调心肌细胞内NAD+的表达进而促进SIRT1 介导的PGC-1α 去乙酰化，从而增加线粒体生物生成，减缓心肌衰老程度，而敲减PGC-1α则可阻断上述作用［45］。在人脑微血管内皮细胞中，敲减PGC-1α能够减少ATP 生成并引起细胞衰老；而在放射诱导的衰老细胞中，组蛋白脱乙酰酶的表达水平显著下降，导致PGC-1α 的乙酰化水平上升，这可能是此时细胞衰老发生的机制之一［46］。以上研究提示，PGC-1α 可通过调节线粒体生物生成和ROS 水平等在决定细胞衰老过程中发挥重要作用，因此以调节PGC-1α 表达和表观遗传为靶点的抗衰老策略，可能在ARD治疗中具有潜在的应用前景。

除了生物生成，降解对于控制线粒体的质量同样重要。线粒体自噬作为一种选择性自噬类型，可特异性降解细胞内受损或多余的线粒体［47］。哺乳动物线粒体自噬的一般过程为：线粒体表面的PTEN诱导假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）招募parkin 蛋白及其他因子至线粒体外膜，将受损线粒体分离出来；parkin蛋白继而招募泛素结合因子p62，p62 可与锚定于自噬囊泡膜上的微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）结合，形成自噬小体并包裹受损的线粒体片段，再与溶酶体融合形成自噬溶酶体，从而将线粒体片段降解［48］。此外，还有独立于PINK1-parkin 的线粒体自噬受体，如含FUN14结构域蛋白1、Bcl-2/腺病毒E1B 19 kD 相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19 kD-interacting protein 3，BNIP3）和BNIP3 样蛋白（BNIP3-like protein，BNIP3L/NIX）等［49］。线粒体自噬相关蛋白表达的改变可影响损伤线粒体的降解，与细胞衰老密切相关。有研究表明，衰老小鼠的胫骨前肌细胞中线粒体自噬和生物生成能力下降，功能受损的线粒体大量累积［50］。在过氧化氢诱导的人衰老髓核细胞中，上调PINK1 蛋白的表达可促进线粒体自噬，从而减少功能受损线粒体的累积，抑制细胞衰老的发生［51］。高糖培养可导致小鼠肾小管上皮细胞发生衰老，其机制与高糖降低PINK1 蛋白和视神经蛋白的表达进而抑制线粒体自噬水平有关［52］。血红素加氧酶1能够促进parkin蛋白与线粒体结合，诱导受损线粒体发生自噬，抑制髓核细胞的衰老，从而延缓家兔椎间盘的退变［53］。槲皮苷可通过激活SIRT1/PINK1/parkin 通路，促进线粒体自噬，从而抑制大鼠肾小管上皮细胞衰老［54］。此外，通过诱导线粒体自噬、清除受损的线粒体还可有效阻断人衰老成纤维细胞的SASP转化［55］。

以上结果表明，线粒体生物生成和降解的动态平衡对保障线粒体的质量至关重要；生物生成和（或）降解的减少均可引起细胞衰老，线粒体质量控制是值得关注的抗衰老作用靶点。

6 靶向线粒体的抗细胞衰老策略

基于线粒体功能在细胞衰老中的重要作用，开拓以线粒体为靶点的改善细胞衰老的方法逐渐受到人们的关注。但目前已知的抗细胞衰老药物均主要针对清除ROS和降低氧化应激损伤等经典机制。有研究发现，褪黑素能够降低衰老间充质干细胞的ROS 水平，提高线粒体膜电位，促进损伤线粒体发生自噬，从而抑制细胞衰老的发生发展，而衰老间充质干细胞经褪黑素处理后能够通过抑制细胞凋亡、诱导细胞增殖和血管新生，进一步促进小鼠缺血下肢的功能恢复［56］。MitoQ 是一种靶向线粒体的抗氧化剂，能够特异性清除线粒体ROS。在阿尔茨海默病小鼠模型中，MitoQ 可减轻脑组织的氧化应激并减少β-淀粉样蛋白的表达，从而提高老年小鼠的认知能力，且MitoQ 还可以显著延长小鼠的寿命，这提示靶向清除线粒体ROS是治疗阿尔茨海默病的一种潜在有效方法［57］。另一种靶向线粒体的抗氧化剂SKQ1可通过抑制视网膜细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的活性来抑制细胞衰老，从而减轻大鼠老年性黄斑变性症状的严重程度［58］。

线粒体治疗（mitotherapy）是指将外源性的正常线粒体移植到线粒体功能障碍的细胞中，以恢复细胞活力。最近的一项研究发现，将年轻小鼠肝脏内功能正常的线粒体通过尾静脉注射至衰老小鼠体内，这些线粒体可进入并稳定存在于衰老小鼠的脑、骨骼肌、肝、肾、心和肺组织中，尤其是富含线粒体的脑和骨骼肌细胞。更重要的是这些年轻线粒体可发挥作用，显著提高脑和骨骼肌细胞内线粒体呼吸相关酶的表达并降低ROS水平，改善衰老小鼠的学习、记忆和运动功能［59］。以上研究提示，恢复衰老细胞的线粒体功能，有望成为预防和治疗细胞衰老的有效策略。

7 结语与展望

近年来的研究逐步深入地揭示了线粒体功能障碍引起细胞衰老的多种机制，包括动力学改变、能量代谢障碍、质量控制失衡等，为以调控线粒体稳态为目标防治细胞衰老的策略提供了有力证据。然而这些机制在不同原因、不同类型细胞衰老中的作用以及是否通过协同作用促进细胞衰老，仍有待进一步探讨。目前，靶向清除线粒体内ROS 的疗法表现出一定的抗细胞衰老效果，但仍需进行以线粒体相关机制为靶点的药物研发，以及提升抗细胞衰老的效果。相信随着衰老细胞检测方法和线粒体检测技术的不断发展，关于线粒体功能障碍在多种类型细胞衰老中作用的认识会更加清晰，这将为以线粒体为靶点而精准治疗ARD提供科学依据和新思路。