Eph互作交换蛋白家族活性调控及调控异常相关疾病的研究进展*

陈 凤， 吴英杰， 秦应和

（中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193）

Eph（erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma）互作交换蛋白（Eph-interacting exchange protein，Ephexin）是鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）家族的最大亚家族Dbl（diffuse B-cell lymphoma）的亚群之一，主要在Ephrin 配体与Eph受体介导的信号下激活，从而参与Rho蛋白的活性调节［1-2］。Rho 蛋白是一类分子大小为20～30 kD 左右的Ras 超家族成员之一，因其自身具有一段能将GTP 水解成GDP 的保守氨基酸序列，所以又叫Rho GTP 酶。RhoGEFs 是Rho 蛋白的三大调节因子之一，与Rho GTPase 活化蛋白（Rho GTPase-activating proteins，RhoGAPs）及Rho 鸟苷酸解离抑制因子（Rho guanine nucleotide dissociation inhibitors，RhoGDIs）共同控制非活性Rho-GDP 与活性Rho-GTP之间的动态平衡，对细胞生长、迁移、凋亡、细胞周期、细胞骨架形成、基因表达及病毒感染等生理生化活动至关重要。目前为止，已经确认5个与Eph互作的交换蛋白，根据发现的时间先后顺序分别命名为Ephexin1、Ephexin2、Ephexin3、Ephexin4 和Ephexin5，它们都是Rho、Ras 相关的C3 肉毒毒素底物1（Rasrelated C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）和细胞分裂周期蛋白42（cell division cycle protein 42，Cdc42）等常见Rho 蛋白的GEFs。Ephexins 的鸟苷酸交换活性失调及Rho 蛋白激活异常都可能导致癌症等诸多疾病的发生，所以了解Ephexins 活性调控的分子机制及Ephrin/Eph 信号如何参与调控Rho 蛋白的活性对Ephexins调控相关疾病的治疗至关重要。

1 Ephexins家族

1.1 Ephexins 的结构与功能 Ephexins 家族的共同结构特点为含有一个由200 个氨基酸组成的Dbl homology（DH）结构域和与其串联的Pleckstrin homology（PH）结构域。除了Ephexin5 之外，其它Ephexins 家族成员还含有一个SH3 结构域。Ephexins 的功能域在同源蛋白中高度保守，其中DH 域主要负责GEFs的鸟苷酸交换活性，并与相邻PH 域形成鸟嘌呤核苷酸交换反应的最小催化单元，DH 域的结构阻遏量决定了Ephexins 和Rho 蛋白之间的偶联特异性，因此，一些Ephexins 成员对Rho 蛋白的鸟苷酸交换活性具有特异性［3］。而PH 域则协同促进Rho 蛋白的活化，介导GEFs的亚细胞定位［4］。SH3域可以通过分子内或分子间的互作而调节含有该结构域的GEFs 的活性［5］。除此之外，一些Ephexins家族成员的其他结构域也可以通过分子内互作阻碍其鸟苷酸交换活性，比如Ephexin4 的N20 结构域（第234 和378 位氨基酸之间的区域），Ephexin3 的N 端螺旋结构域（Helix）及Helix 和DH 域之间一段富含脯氨酸的基序（PxxP）等。虽然第一个Ephexin 被发现距今已20 余年，但Ephexins 在生理和病理环境中的功能及调节机制最近才被揭示。

1.2 Ephexins激活的分子机制

1.2.1 Ephrin/Eph 信号对Ephexins活性的调控 细胞内的Ephexins 主要受Ephrin/Eph 信号调控。Eph受体是哺乳动物基因组中最大的受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）家族，属于跨膜RTK超家族。基于序列同源性及对EphrinA和EphrinB配体的亲和性，Eph受体分为EphA和EphB两种。通常情况下，EphA 与EphrinA 互作，EphB 与EphrinB 互作。然而也有一些例外，例如，EphrinB2 和EphrinB3可以与EphA4结合，EphrinA5可以与EphB2结合［6-8］。Ephrin/Eph互作提供了一种独特的双向信号机制，即Eph受体诱导的信号称为正向信号，Ephrin配体启动的信号称为反向信号，且正反向信号均可通过酪氨酸磷酸化依赖或非依赖转导途径进行转导［9］。Ephexins 作为Eph 受体的直接下游蛋白，在Ephrin/Eph 介导下参与轴突导向、细胞迁移与凋亡、血管生成与血管平滑肌收缩等多种下游信号通路。目前为止，只有Ephexin2的Eph受体还未见报道［2］。

Ephexin1 在EphA4 的诱导下激活RhoA；缺失Ephexin1 影响小鼠出生后发育过程中突触的成熟，从而导致成年小鼠神经肌肉接头处神经传递受损与肌无力；Ephexin1 缺失引起的RhoA 活性降低是神经肌肉接头异常的主要原因［10］。在骨骼肌细胞中，EphrinA 与EphA4 结合诱导Ephexin1 的第87 位酪氨酸发生磷酸化，从而增强Ephexin1对RhoA 的鸟苷酸交换活性，但不改变其对Rac1 或Cdc42 的鸟苷酸交换活性［11］。Chang 等［12］首次通过体内实验表明，Ephexin1 在雏鸡和小鼠胚胎中指导脊髓外侧运动柱的轴突导向，并提到Ephexin1 可能在EphB 信号转导中发挥一定的作用。

Ephexin3 在EphA4 的诱导下主要激活RhoA，参与细胞迁移和肌动蛋白动力学的调控［13-14］。Ephexin3与Ephexin1 的作用机制不同。在神经肌肉接头的早期发育中，Ephexin1 发挥关键作用，而Ephexin3 的缺失虽然会导致RhoA 和Cdc42 的活性降低，但是不会影响神经肌肉接头的早期发育［14］。Wang 等［15］通过体外实验证明Ephexin3 还可以弱激活Rho 家族的其它成员RhoC 和RhoG，但具体生理功能还有待进一步研究。

Ephexin4 在EphA2 的诱导下特异性激活RhoG，从而参与乳腺癌细胞迁移。EphA2 受体的第897 位丝氨酸磷酸化既可以增强其与Ephexin4 的结合，促进癌细胞的迁移［16］，也可以招募RhoG 定位到细胞膜，促进细胞分裂M期的正常进行［17-18］。

Ephexin5 的DH-PH 域酪氨酸在EphrinA/EphA4介导下发生磷酸化，磷酸化的Ephexin5 进一步激活RhoA，从而参与血管平滑肌收缩相关的应力纤维的形成［19］。正常生理状态下，Ephexin5 与EphB2 结合抑制兴奋性突触的形成［20］。当EphrinB 与EphB2 结合诱导Ephexin5 磷酸化，使其被泛素-蛋白连接酶E3A 泛素化并被蛋白酶体降解时，Ephexin5 对兴奋性突触形成的抑制效应才被解除。另外，蛋白激酶C可以介导Ephexin5 的第107 和109 位丝氨酸残基发生磷酸化，以非配体依赖形式激活RhoA 并参与调控神经元树突棘的形成［21］。上述研究结果表明，Ephexins通过Ephrin/Eph信号参与多种细胞事件。

1.2.2 Ephexins 自抑制状态的调控 在基础状态下，Ephexins 的鸟苷酸交换活性是受到抑制的，当Ephexins 与Eph 结合才能诱导Rho 蛋白的激活。目前为止，研究者普遍认为Ephexins 的自抑制状态是Ephexins分子内互作封闭其催化区域所致。

Ephexin1 与Ephexin3 的活性调控机制相似。Ephexin3 的活性受N 端Helix 区域与DH 域的互作影响。突变Helix 区域的关键氨基酸或截短此段氨基酸序列都可以完全解除Ephexin3 的自抑制状态。另外，Ephexin3 的第1 097 和1 100 位酪氨酸磷酸化也可以破坏其分子内互作，使RhoA 与Ephexin3 的DH域结合并被激活［22］。He 等［23］发现，Ephexin3 的SH3域与PxxP 域的结合是Ephexin3 自抑制状态稳定的前提，通过人为设计靶向SH3 域的肽段也可以解除Ephexin3 的自抑制状态。鸟嘌呤核苷酸交换分析也证实这种靶向SH3 的肽段能有效增强Ephexin3 催化的鸟苷酸交换反应［24］，但是生理状态下的具体功能有待进一步研究。

Ephexin4 的活性调控机制不同于Ephexin1 和Ephexin3，其SH3 域与N20 域互作形成低聚物，阻碍RhoG 的结合与激活。突变SH3 域与N20 域互作区域的关键氨酸残基，Ephexin4 与RhoG 的结合增加，RhoG 活化增强［25］。当吞噬和细胞运动蛋白1（engulfment and cell motility protein 1，Elmo1）存在时，由于Elmo1 可以结合Ephexin4 的SH3 域，导致SH3 域与N20 域的分子内互作中断，从而促进RhoG 与Ephexin4 结合，协同促进凋亡细胞的清除［26-27］。总之，突变、截短及磷酸化分子内互作区域的关键氨基酸是解除Ephexins家族自抑制状态的三大主要方法。

Ephexin2 和Ephexin5 分子内互作介导的自抑制暂时还没有报道。

2 Ephexins对Rho蛋白的调控

Ephexins 作为GEFs 家族中的一员，激活之后调控Rho 蛋白活性的机制与其他RhoGEFs 一样，通过促进Rho-GDP 向Rho-GTP 的转换激活Rho 蛋白。GDP 和GTP 结合态的变化伴随Rho 蛋白构象的改变，从而决定了Rho 蛋白对下游效应因子的亲和力，亲和作用的变化直接导致相应下游信号通路的激活，并以此产生对应的细胞反应。

RhoGAPs 通过水解Rho-GTP 上的GTP 促进Rho-GDP 产生，虽然Rho 蛋白自身也具有GTP 水解活性，但仍然需要RhoGAPs 加速GTP 的水解，以达到高效构象转换的目的［28］。

RhoGDIs 在胞质中结合并隐藏Rho 蛋白的疏水异戊烯基团，抑制Rho 蛋白上的GDP 解离和GTP 水解活性，促使Rho 蛋白远离细胞内活跃的膜位点而隔离在胞质当中［29-30］。

3 Ephexins调控的相关疾病

Ephexins 家族成员的活性失调、功能异常及其相关联的Rho 蛋白活性异常都会导致严重的疾病。另外，已经在不同类型的癌症中观察到Eph 受体或Ephrin 配体的异常表达或突变［2］。所以从这些信号模块及Rho 蛋白调节因子着手可能是Ephexins 调控相关疾病治疗的一个方向。

早期脑损伤是蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）患者死亡的主要原因。Fan 等［31］发现，SAH 小鼠体内EphA4 及其下游蛋白Ephexin1、RhoA 和Rho 相关激酶2（Rho-associated kinase 2，ROCK2）的表达显著升高，siRNA 敲减EphA4之后，SAH 相关异常表型得到改善，提示EphA4/Ephexin1/RhoA/ROCK2 通路可能为人类SAH 的治疗提供新的线索。另外，EphA4 及其下游蛋白Ephexin1 还与抑郁症相关联。当使用EphA4抑制剂抑制抑郁样小鼠体内的EphA4表达时，小鼠的抑郁样表型明显减轻，所以靶向EphA4的药物研究可能是间接治疗抑郁症的一个潜在研究方向［32］。因为一些直接治疗的药物具有明显的副作用，比如，去甲丙咪嗪（desipramine）作为一种抗抑郁药物，通过促进EphA4 的聚集而过度激活其下游效应因子Src，触发长时程增强效应衰减，从而导致记忆受损［33］。而且EphA4 正向信号的过度激活会破坏脊柱的形态并阻碍其功能［34］。总之，由于Ephexin1 在神经元发育和突触稳态方面的作用，所以在中枢神经系统损伤后的恢复及抑郁症患者中均能观察到Ephexin1的异常［31-32］。

Ephexin2 主要在肿瘤中发挥作用。非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）是一种常见的肺癌，约占所有肺癌类型的85%左右［35］。NSCLC 患者体内的Ephexin2 水平明显高于正常人，并以一种独立于RhoA 的方式激活MAPK/ERK 通路并促进NSCLC 的增殖和转移。Li等［36］的研究表明，miR-29b通过下调Ephexin2 的表达可以抑制NSCLC 的发展。另外，肺癌患者组织中粒状头样转录因子2（grainyhead-like transcription factor 2，GRHL2）高表达，Pan 等［37］发现GRHL2 可能通过靶向结合下游效应蛋白RhoG 抑制NSCLC 的转移，所以Ephexin2 与RhoG 在NSCLC 中的关系值得进一步研究。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是人类最致命的癌症之一，中国是全球肝癌发病率和死亡率最高的国家。目前为止，有关肝癌发生发展的研究，大部分集中于RNA 甲基化修饰［38］。Zhou 等［39］的研究表明，Ephexin2 是HCC 中miR-503 的直接靶基因，首次证明miR-503 通过下调Ephexin2 的表达可以抑制肝癌细胞的增殖与转移。另外，RhoC 的表达增加影响HCC 细胞的转移，抑制RhoC 的表达能有效抑制HCC细胞的侵袭和迁移，但对细胞的存活和增殖没有明显影响［40］。目前为止，Ephexin2 与RhoC 在HCC 中是否协同发挥作用尚未知，但是Ephexin2 与RhoC 很可能成为肝癌的预后指标及治疗靶点。

Ephexin3 主要在乳腺癌细胞系及原发性乳腺癌中表达，提示Ephexin3 可能在乳腺癌中发挥一定功能。目前为止，Ephexin3 相关的乳腺癌介绍较少，不过乳腺癌患者中常见EphA2 的过表达，以非配体依赖形式促进癌细胞的迁移和侵袭［41］。而乳腺癌作为第二普遍和致命的恶性肿瘤，进一步研究Ephexin3和EphA2 在乳腺癌中关系可能很有必要。另外，肺癌患者的全基因组测序结果显示Ephexin3 突变频繁［42］。宫颈癌、结直肠癌及肺癌患者体内都能观察到较高水平的Ephexin3，并且Ephexin3 与Src 的水平越高，患者生存时间越短［43-44］。

Ephexin4 对癌细胞的增殖、生长及肿瘤发生至关重要。Ephexin4 在曲酸刺激的A375 恶性黑素瘤细胞中表达下调，是黑色素瘤细胞中的肿瘤抑制基因，提示其可能参与癌症的预防［45］。但是结肠癌患者体内的Ephexin4 水平明显升高，Ephexin4 诱导的结肠癌细胞增殖与迁移依赖于Src 家族激酶成员FYN，通过敲减FYN的表达可以降低Ephexin4 的蛋白水平，从而抑制结肠癌细胞进展［46］。因此，联合靶向Ephexin4和FYN可能是一种相对有效的结肠癌治疗方法。在乳腺癌中，Ephexin4 以RhoG 依赖的方式调节乳腺癌细胞的迁移［41］。另外，EphA2的第897位丝氨酸磷酸化可以增强其与Ephexin4 的结合，进一步促进癌细胞的迁移［16］。Ephexin4 还与脑肿瘤的发生有关，在少突胶质细胞瘤患者中，Ephexin4 的错义突变（2125G 到2125A）明显高于正常人，但是具体发病机制有待进一步阐明［47］。

Ephexin5 主要与阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）及癫痫等神经系统疾病有关。AD 的病理特征之一就是β-淀粉样蛋白沉积，且AD患者大脑海马中的Ephexin5 表达明显高于正常人。在AD 小鼠模型中，利用shRNA 敲减Ephexin5 或通过Rho 激酶抑制剂处理AD小鼠，都可以挽救AD的行为缺陷，大脑海马中β-淀粉样蛋白沉积明显降低［48-49］，提示靶向AD 患者海马中β-淀粉样蛋白是治疗AD 的一个方向。癫痫是Angelman 综合征（Angelman syndrome，AS）的特征之一，AS 小鼠模型重现了AS 患者的标志性特征，其中Ephexin5 蛋白水平升高且发生折叠错误是特征之一。Mandel-Brehm 等［50］发现，降低活性调节的细胞骨架相关蛋白（activity-regulated cytoskeletal-associated protein，Arc）表达可以缓解AS 引起的癫痫，但是降低AS 小鼠Ephexin5 表达并不会改善AS的相关缺陷。癫痫患者的Ephexin5发生1810C至1810T 的错义突变，从而降低Ephexin5 对RhoA 的鸟苷酸交换活性［51］，所以可能是Ephexin5 的鸟苷酸交换活性而不是其表达水平影响了AS 患者的神经元兴奋性。另外，胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者肿瘤组织中的Ephexin5表达上调，促进PDAC 细胞的增殖与迁移［52］。因此，Ephexin5可能是PDAC的治疗靶点之一。

4 结语

Rho 蛋白在RhoGEFs、RhoGAPs 及RhoGDIs 等调节因子的调控下参与多种细胞生命活动。Ephexins作为RhoGEFs 中的一员，主要在Ephrin/Eph 信号的介导下参与Rho 蛋白的活性调节。大量研究表明，Ephexins 分子内互作使Ephexins 的鸟嘌呤核苷酸交换活性处于受抑制的基础状态。Ephexins 的激活及其对Rho 蛋白的调控对生物体的正常生理生化活动至关重要。关于Ephexins 自抑制状态的解除及活性异常相关疾病之间的关系复杂且尚不完全清楚。深入了解Ephrin/Eph 信号介导的Ephexins 活性调节对于阐明相关疾病的发生机制十分重要，也将为临床治疗提供靶点，促进相关药物的研发。