盐霉素联合17-AAG促进人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的机制研究

吴 博，赵菊梅，杜 娟，刘 楠

(1.延安大学医学院组织学与胚胎学教研室，陕西 延安 716000；2.延安市中医医院脾胃肝病科，陕西 延安 716000)

乳腺癌(Breast Cancer)是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有120 万妇女患乳腺癌。我国目前虽不属高发国家，但乳腺癌发病率上升较快，在许多大城市，其发病率已经占据女性恶性肿瘤的首位。乳腺癌细胞之间疏散、易脱落，游离的癌细胞随血液或淋巴液播散到全身，形成转移，极大损害女性健康及至危及性命[1]。目前针对乳腺癌的主要治疗手段为：手术治疗同时辅助化疗、内分泌治疗、靶向治疗。其中，化疗在乳腺癌的综合治疗中占据重要地位，对延缓或避免肿瘤复发、延长患者生存期起着重要作用，但同时乳腺癌患者对化疗药物的耐药现象普遍存在。盐霉素(Salinomycin，以下简称Sal)，是羧基载体类钾离子载体抗生素，一种新型的抗肿瘤药物,其来源于白色链霉菌(菌株号：No.80614)发酵液。多名研究者用Sal与多种癌细胞及癌干细胞进行研究[2-4]，结果均表明Sal能够抑制多种癌细胞及癌干细胞的生长及转移，并诱导其凋亡。17-烯丙胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-allyl-amino-17-demethoxygeldanamycin，17-AAG) 是在Hsp-90抑制剂格尔德霉素的结构基础上改造而成的新型抗肿瘤药物，与格尔德霉素相比，其毒性降低，稳定性提高。17-AAG抗肿瘤的作用已被广泛认可。实验研究多与其他药物或治疗手段联合，如联合顺铂、吉西他滨、重离子辐射等[5]。

Sal与17-AAG为潜在化疗药物，在前期针对胃癌的研究中发现，两种药物联合使用可以通过调控凋亡过程诱导胃癌细胞死亡。但两药联合使用对乳腺癌的作用研究较少，联合用药是否可以通过调控凋亡改变癌细胞对药物的敏感度，从而抑制乳腺癌细胞的增殖仍不清楚。本研究拟将Sal与17-AAG联合用药，探索其对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用及其机制，旨在挖掘乳腺癌治疗的新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人乳腺癌细胞系MCF-7，延安大学医学院肿瘤重点实验室保存。

1.2 药品与试剂

Sal，规格：80 mg，购自中国兽医药品监察所(批号K0141606)；17-AAG，规格：500 μg，购自美国SIGMA公司(批号100069-500UG)；细胞裂解液、蛋白质定量试剂盒、CCK-8检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒均为碧云天生物技术有限公司生产；反转录试剂盒，北京全式金生物技术有限公司生产; 实时荧光定量聚合酶链反应( qPCR) 试剂盒，康润生物有限公司生产。RPMI-1640培养液、胎牛血清、胰酶+EDTA，美国HyClone公司生产；DMSO，上海索莱宝生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 设置实验组及对照组 ①实验组Sal单药组：4 μmol/L；17-AAG单药组：2 μmol/L；联合用药组：Sal 4 μmol/L+17-AAG 2 μmol/L；②对照组野生型乳腺癌细胞组：不做任何处理，正常培养，作为空白对照。

1.3.2 细胞培养 人乳腺癌细胞系MCF-7培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中。培养条件：37℃、5%CO2饱和湿度。每天观察细胞状态，根据细胞生长情况，每1～2 d更换完全培养基，当细胞生长到对数生长期时，可传代、种板、冻存或进行下一步实验。

1.3.3 CCK8检测MCF-7细胞增殖情况 取对数生长期的MCF-7细胞，用0.25%胰酶消化后计数种于96孔板中，每孔约7000个细胞。将培养板在培养箱预培养24 h后，弃去原培养基，更换为100 μL/孔溶有不同浓度药物培养基。培养24 h及48 h后，分别弃去溶有药物的培养基，重新加入溶有CCK8的培养基100 μL(每100 μL培养基含有10 μL CCK8溶液)。将培养板在培养箱内孵育3 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。每组3个复孔，实验重复3次。

1.3.4 流式细胞术检测MCF-7凋亡情况 细胞消化后计数种于24孔培养板中，每孔 2×105个细胞，轻轻摇晃培养板使细胞分布均匀，培养板放入37℃细胞培养箱过夜，第2天待细胞汇合度约 70%～80%时进行加药处理。药物处理48 h后收集细胞悬液，调整细胞浓度为 5×105/mL，PBS清洗离心去上清后，分别加入500 μL Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V 5 μL，室温避光30 min，加入PI 5 μL，避光反应10 min后加入Binding Buffer 400 μL重悬，流式细胞术检测细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.3.5 实时荧光定量PCR检测与凋亡相关基因表达情况 药物处理48 h后分别提取未处理空白对照组、Sal单药组、17-AAG单药组及联合用药组总RNA，逆转录成cDNA,并采用实时荧光定量PCR从基因水平检测与细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2、Beclin-1的相对表达量。实验重复3次。

1.4 统计学方法

所有数据使用 SPSS 19.0 (美国芝加哥)软件处理。应用t检验或卡方检验分析实验各组间的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 联合用药对MCF-7细胞增殖的影响

根据“抑制率=(1-实验组OD)/对照组OD×100%”计算药物对MCF-7细胞增殖的抑制率。加药24 h后，Sal单药组、17-AAG单药组、联合用药组的抑制率为(3.36±0.01)%、(8.32±0.01)%、(7.48±0.02)%，抑制率无明显差异；加药后48 h其抑制率分别为(8.16±0.01)%、(9.91±0.01)%、(17.88±0.02)%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，表明加药物48 h后，联合用药显著抑制MCF-7细胞增殖(见图1)。

图1 各组细胞增殖抑制率

2.2 联合用药对MCF-7细胞凋亡的影响

Sal与17-AAG联合用药组早期凋亡率为(6.42±1.70)% ，显著高于空白对照组(4.24±0.90)%、Sal单药组(4.79±0.89)%，以及17-AAG单药组(2.78±1.10)%，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05，见图2)。

图2 盐霉素联合17-AAG诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡

2.3 凋亡相关基因表达情况

Bcl-2在联合用药组中的相对表达量为0.567±0.012，与空白对照、Sal单药组、17-AAG单药组相比，表达显著降低(P<0.05)。而Caspase-3、Beclin-1、Bax在联合用药组中的相对表达量分别为1.82±0.10、1.89±0.09、1.74±0.12，均显著高于其余三组对照组，组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05，见图3)。

图3 凋亡相关基因的表达情况

3 讨论

实验结果显示，药物联合作用MCF-7细胞的凋亡率明显上升，凋亡相关基因Beclin-1、Caspase-3、Bax表达量显著增高、Bcl-2表达量显著下调。相关研究提示Beclin-1是一种自噬基因，它与Bcl-2抗凋亡蛋白结合直接调控自噬和凋亡[6]；此外Bax是一种促凋亡基因，其基因表达受到P53调控，P53可上调促凋亡基因如Bax、PUMA、NOXA转录，抑制抗凋亡基因Bcl-2转录；P53还可转录激活AMPK通路而抑制mTOR诱导凋亡及自噬[7-8]，推测联合用药促进乳腺癌MCF-7凋亡的机制可能为通过调节相关信号通路如PI3K/Akt /mTOR、MAPK、JNK等，使Bcl-2磷酸化，从而释放Beclin-1激活自噬；而Bcl-2是抗凋亡基因，其又可以和Bax相互调节并促进Caspase家族及其底物PARP的降解，从而影响凋亡。此外Caspase-3还可能通过剪切灭活Beclin-1抑制自噬促发凋亡[9]。

相关研究显示Sal能克服肿瘤细胞对化疗药物的耐受，提高传统化疗药物的敏感性，与多种抗肿瘤药物联合应用表现出协同效应，诱导肿瘤细胞死亡，如Sal与藜芦醇联合后ROS大量增加，导致乳腺癌细胞凋亡[10]。此外Sal还可以和酶抑制剂联合使用，如与LBH589联合后，可通过调控三阴性乳腺癌干细胞的周期及EMT诱导细胞死亡[11]。17-AAG的主要抗肿瘤机制是可以通过特异性竞争抑制 HSP-90 氨基端的ATP 酶活性，使HSP-90 处于 ADP 结合构型，阻碍HSP-90 多分子伴侣复合体形成，导致泛素介导的HSP-90客户蛋白广泛降解，这些客户蛋白中很多是细胞内信号分子，参与多条信号转导通路，进而影响肿瘤的发生发展过程[12]。目前针对17-AAG对乳腺癌作用的相关机制还不多见，有学者猜测，AKT是HSP-90 的重要底物蛋白，17-AAG能直接影响AKT 的稳定性并导致AKT 的缺失表达，从而有效地增加乳腺癌细胞对化疗的敏感度。

综上所述，近年来Sal联合其他化疗药物杀伤肿瘤细胞已逐渐成为肿瘤治疗的新策略。但是Sal联合用药杀伤肿瘤细胞的具体机制还不清楚，进一步阐明其作用机制将为联合用药进入临床和寻找有效药物靶点打下坚实的理论基础。