miRNA-296在胃黏膜癌前病变中的表达及临床意义

郭汉青，庄 坤，马茵茵，陈晓露*

(1.西安市中心医院消化内科，陕西 西安 710003；2.陕西省人民医院，陕西 西安 710068)

我国是胃癌的高发国家[1]，近年来随着内镜技术的推广，胃癌的诊断率越来越高，但由于中晚期胃癌预后差，如何甄别早期胃癌甚至癌前病变，对于降低胃癌的发病率和死亡率具有重要意义。胃黏膜的肠上皮化生是胃癌最重要的癌前病变，也是肠型胃癌的高危因素[2]。在经典的胃癌演变过程中，从慢性萎缩性胃炎到肠上皮化生、非典型增生再到胃癌[3]，是一个基因调控和表达异常积累的过程，包括编码蛋白的相关基因的表达异常，诸如microRNA等非编码RNA的表达异常，其病因涉及Hp感染和胆汁酸反流等[4]。前期研究表明miRNA-296在胃癌中的表达明显高于癌旁的肠化生组织，并且miRNA-296通过调控靶基因CDX1的表达进而影响胃癌的发生、发展[5]。但在胃黏膜的癌前病变多阶段中，miRNA-296的表达及调控机制目前尚不清楚。本研究通过检测miRNA-296-5p及miRNA-296-3p在慢性浅表性胃炎(chronic superficial gastritis,CSG)、慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)、肠上皮化生(intestinal metaplasia,IM)和异型增生(dysplasia,Dys)组织中的表达，分析miRNA-296-5p/3p在胃黏膜癌前病变中的表达情况，并通过胆汁酸刺激胃黏膜细胞，检测其对miRNA-296表达的影响，从而揭示其在胃黏膜癌前病变中的意义。

1 对象与方法

1.1组织芯片分组

本研究所用组织芯片购买自艾莉娜生物公司，为182例患者的石蜡包埋胃组织样本，每份样本来自不同患者。依据Pelayo Correa，等[6]对胃黏膜癌前病变的分类方法，将182例病变组织分为4组：慢性浅表性胃炎(CSG)组45例、慢性萎缩性胃炎(CAG)组47例、肠上皮化生(IM)组59例、异型增生(Dys)组31例。各组患者年龄及性别组成具有可比性(P>0.05)。

1.2 主要试剂

地高辛(DIG)3′端和5′端双标记的miR-296-5p和miR-296-3p探针购买于EXIQON公司；原位杂交检测试剂盒和寡核苷酸稀释液购自Qiagen公司；显示系统为生物素化鼠抗地高辛和过氧化物酶标记的链霉亲和素-生物复合物(SABC)；胎牛血清、RPMI-1640培养基均购自美国Thermo公司，人胃黏膜上皮细胞系GES-1细胞购自中科院上海细胞库；鹅去氧胆酸(CDCA)购自Sigma公司；TRizol试剂购自Invitrogen公司；PrimeScript Rt试剂盒购自TaKaRa公司；PCR引物由广州锐博生物技术公司合成。

1.3 原位杂交观察miRNA-296-3p/5p在胃组织中的表达

将组织芯片进行烤片、脱蜡，梯度乙醇依次水化，各5 min；磷酸缓冲盐液(PBS)冲洗2次，每次30 s；4%多聚甲醛固定10 min，1×PBS冲洗2次，每次5 min；0.3%枸橼酸稀释蛋白酶K10 g/mL，37℃消化5 min；0.1 M PBS(pH7.2)浸泡10 min；0.1 M甘氨酸/0.1 M PBS浸泡5 min；0.3%TritonX-100/0.1 M PBS浸泡10～15 min。0.1M PBS冲洗5 min×3次，加蛋白酶K(1 μg/mL)，37℃孵育30 min。 4%多聚甲醛固定5min。0.1 M PBS冲洗5 min×2次，浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1 M三乙醇胺中10 min。滴加适量预杂交液，42℃ 30 min。弃杂交液，切片上滴加10 μL杂交液(将探针变性后稀释在预杂交液中，0.5 ng/μL)，覆以盖玻片或蜡膜，42℃过夜。4×枸橼酸氯化钠缓冲液(SSC)、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20 min；0.2×SSC 37℃冲洗10 min；0.2×SSC与0.1 M PBS各冲洗10 min；0.05 M PBS冲洗5 min×2次。3%BSA/0.05 M PBS 包被，37℃ 30 min。滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物(以抗体稀释液1∶5000稀释)4℃孵育过夜。0.05 M PBS冲洗15 min×4次；TSM1 10 min×2次； 新鲜配制TSM2 10 min×2次。显色：在玻片上滴加适量显色液，4℃避光过夜，将玻片置于TE中10～30 min以终止反应，酒精梯度脱水、二甲苯脱脂，中性树胶封片。阳性表达的细胞数比例评分标准：<1% (0分),1%～25% (1分),26%～50% (2分),51%～75% (3分),>75%(4分)；染色程度强弱评分：阴性(0分),+ (1分),++ (2分)，+++ (3分)。上述积分相乘得到积分0～4分为低表达，5～12分为高表达。染色结果均由病理医师判读和确认。

1.4 CDCA刺激GES-1细胞及RNA检测方法

人胃黏膜上皮细胞系GES-1细胞培养于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中；CDCA刺激细胞方法: GES-1细胞贴壁培养，无血清培养基培养24 h，50 μM CDCA刺激24 h，收集细胞，提取细胞总RNA。通过TRizol试剂提取培养细胞的总RNA，使用PrimeScript RT试剂盒进行逆转录PCR。采用加尾法对反转录产物进行miRNA表达量的检测，3′-5′均为Poly U,5′-3′的引物序列如下：min-296-5P为TGCCTAATTCAGAGGGTTGG，miRNA-256-3p为GAGGGTTGGGTGGAGGCTCTCC，使用SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)进行实时定量PCR，并在LightCycler 480系统(罗氏)中进行测量。U6表达用作内部对照，U6引物：U6-F:5-GCGCGTGCTGAAGCGTTC-3，U6-R：5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3。2-△△CT是指与校准样品相比，一个样品的RNA表达的倍数变化。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 18.0对数据进行处理。计数资料用卡方检验，计量资料使用t检验。

2 结果

2.1 不同程度胃黏膜病变中miR-296-5p和miR-296-3p的表达情况

在CSG、CAG、IM、Dys病变组织中，miR-296-5p的高表达率分别为75.6%(34/45)，74.5%(35/47)，33.9%(20/59)，32.3%(10/31)，与CSG相比，miR-296-5p在CAG中的表达差异无统计学意义，而在IM、Dys中的表达均明显降低(均P<0.001)；miR-296-3p的高表达率分别为73.3%(33/45)，61.7%(29/47)，50.8%(30/59)，29.0%(9/31)，与CSG相比，miR-296-3p在CAG中的表达无显著变化，而在IM、Dys中的表达均明显降低(P<0.05，P<0.001)，详见表1、图1。

图1 miR-296-5p及miR-296-3p在胃黏膜癌前病变组织中的表达(SP×80/SP×16)

表1 各组中miR-296-5p和miR-296-3p的表达统计分析

2.2 CDCA刺激后miRNA-296-5p/3p表达情况

以空白(NC)组中mir-296-5p的表达为参照，经CDCA刺激人胃黏膜上皮细胞系GES-1细胞后miRNA-296-5p和miRNA-296-3p的表达水平明显降低，差异有统计学意义(见图2)。

图2 CDCA刺激造成miR-296-5p和miR-296-3p在胃细胞中表达降低

3 讨论

miRNAs是重要的小非编码RNAs，通常在肿瘤细胞中表达异常，miRNA通过抑制原癌基因和抑癌基因mRNA的退化或中断翻译或两者结合发挥作用[7]。在这些miRNAs中，miR-296被发现在调控多种恶性肿瘤表型的发生和发展中起一定作用。在食管癌中，高表达的miR-296预示低生存率，而降低miR-296水平，在体内和体外通过调节cyclinD1和p27可抑制癌细胞生长[8]。也有研究发现miR-296在肝癌细胞和乳腺癌细胞富集，通过下调p53～p21通路促进肿瘤细胞增殖[9]，我们的前期研究也发现，在胃癌恶性转化中，miR-296能够抑制靶基因CDX1的表达[5]，从而抑制细胞增殖。CDX1是肠化生的关键标志分子，在肠化生组织中表达明显升高，因此miR-296能够促进肠化生组织向胃癌组织进展。在本研究中，我们发现胃黏膜癌前病变中miR-296的成熟体，miR-296-5p和miR-296-3p的表达均逐渐降低，同CSG相比，IM和Dys的胃黏膜组织中，miR-296的表达均明显降低。因而通过原位杂交的方法明确miR-296在胃炎患者中的表达情况，可能具有筛选IM和Dys组织，识别胃黏膜癌前病变的应用前景。但因本研究样本量较小，仍需扩大样本量进行临床验证，并对不同类型的肠化生和非典型增生进行分层分析。

肠化生是胃黏膜癌前病变的重要步骤，其过程受到多种因素的调控。目前认为，引起胃黏膜肠化生的机制包括幽门螺旋杆菌感染、高盐饮食、吸烟、胆汁反流等[4]。其中，胆汁酸作为肠化生的关键诱发机制在近年来逐渐受到重视，大量临床研究证明，胃液中反流的胆汁酸与肠化生发生密切相关[10]；基础研究也发现，人为造成胆汁酸反流的动物模型，能诱导食管和胃黏膜发生肠化生[11]。胆汁酸在机体的天然受体中法尼醇X受体(Farnoid X Receptor，FXR)的研究最为深入[12]，胆汁酸作为其天然配体，激活FXR后能够使后者进入细胞核并结合于特定基因启动子区域，从而调控广泛的靶基因的转录和表达。本研究发现，胆汁酸CDCA刺激胃上皮细胞GES-1后，引起miR-296表达降低，结合我们前期发现miR-296靶向CDX1的结果，这些数据提示胆汁酸抑制miR-296表达，可能是肠化生的胃黏膜组织中CDX1表达逐渐升高的原因之一。

综上所述，本研究显示在胃黏膜病变早期阶段miR-296-5p/3p表达水平较高，并且随着胃黏膜病变进展到萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生等癌前病变阶段，miR-296-5p/3p表达下调。本研究提示miR-296-5p/3p在胃黏膜病变演变过程中可能起保护作用，并从分子通路水平上阐述了CDCA等胆汁酸可能为内源性致癌因子，导致胃上皮细胞发生肠化生乃至癌变。