Prdx1基因敲减促进氧糖剥夺/复氧诱导的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞凋亡*

王海鹏， 刘同帅， 于 群， 张佳文， 王明山△

（1青岛大学附属青岛市市立医院麻醉科，山东青岛266071；2潍坊医学院麻醉学院，山东潍坊261053；3南京医科大学青岛临床医学院，山东青岛266071）

脑血管疾病以其高致残率和高致死率病一直是危害我国中老年人身体健康和生活质量的主要疾病，其中以缺血性脑卒中为主，发病比例约占70%［1］。缺血脑组织恢复血液灌注后，原有损伤可进一步加重，称为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reper⁃fusion injury，CIRI）。目前研究表明，活性氧（reac⁃tive oxygen species，ROS）形成是引起脑缺血再灌注后神经元损伤和死亡的重要机制之一［2-3］，过氧化还原蛋白1（peroxirodoxin 1，Prdx1）作为抗氧化蛋白超家族中的一员，在细胞内参与ROS相关的多种信号通路的调节，发挥抗氧化和清除自由基的功能［4］。Wu等［5］研究表明，在大鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注及离体大脑皮层神经元氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose depriva⁃tion/reoxygenation，OGD/R）模拟的脑缺血再灌注损伤模型中，Prdx1表达量皆显著上调。本项工作以小鼠神经母细胞瘤N2a细胞为研究对象，通过构建OGD/R模型模拟脑神经元缺血再灌注损伤过程，探讨Prdx1基因敲减对OGD/R诱导的离体小鼠神经母细胞瘤N2a细胞凋亡的影响及作用机制。

材料和方法

1 细胞株和主要试剂

小鼠神经母细胞瘤N2a细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。高糖、无糖DMEM培养液及PBS磷酸缓冲液均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自BioInd；细胞增殖与毒性试剂盒（CCK-8）购自上海七海复泰生物科技有限公司；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒及DAPI染色液均购自碧云天生物技术有限公司；c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）抑制剂SP600125购自MCE；MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptRT reagent Kit和TB Green Premix Ex TaqII均购自TaKaRa；riboFECT CPTrans⁃fection Kit、小鼠特异性siRNA及阴性对照序列片段均购自广州锐博生物技术有限公司；二甲基亚砜及RIPA裂解液均购自北京索莱宝公司；ECL发光试剂盒、山羊抗兔的II抗及山羊抗鼠的II抗均购自北京中杉金桥生物技术公司；兔抗小鼠Prdx1、JNK、磷酸化JNK（phosphorylated JNK，p-JNK）、cleaved cas⁃pase-3和β-actin单克隆抗体购自Abcam。

2 主要方法

2.1 N2a细胞培养及实验分组 在5%CO2、95%空气、37℃、饱和湿度的培养箱中，用含有10%FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的高糖DMEM完全培养液对N2a细胞进行培养。培养液每24 h更换1次，2 d后按1∶3比例传代，在保证细胞达到实验密度并处于生长对数期的状态下，按不同实验要求处理细胞。实验中细胞随机分为正常对照（control）组（常规培养，无操作处理）、OGD/R组（无糖培养液、无氧环境中行氧糖剥夺处理8 h，然后恢复常氧常糖培养24 h）、OGD/R+JNK抑制剂（SP600125）组（氧糖剥夺之后复糖复氧同时予10µmol/L SP600125处理，其余培养条件同OGD/R组）、OGD/R+阴性对照序列（siNC）组（瞬时转染阴性对照序列48 h后行OGD/R处理）、OGD/R+siPrdx1组（瞬时转染siPrdx1 48 h后行OGD/R处理）和OGD/R+siPrdx1+SP600125组（在瞬时转染siPrdx1且氧糖剥夺之后复糖复氧同时予10µmol/L SP600125处理，其余培养条件同OGD/R组）。

2.2 N2a细胞OGD/R模型的建立 OGD/R模型制备参考文献［6-7］，并加以改良。根据我们的前期研究，N2a细胞在氧糖剥夺8 h再复糖复氧24 h后，细胞活力显著降低。因此，采用氧糖剥夺8 h再复糖复氧24 h的N2a细胞损伤模型进行后续研究。选取生长良好的N2a细胞，弃掉原有培养液，用PBS清洗细胞3次，更换为无糖DMEM培养液，置于缺氧罐内，以5%CO2和95%N2混合气体置换缺氧罐内空气，于37℃、饱和湿度培养箱内氧糖剥夺8 h。之后，取出细胞将无糖DMEM培养液更换为含10%FBS的高糖DMEM培养液，在5%CO2、95%空气、37℃、饱和湿度培养箱内培养24 h模拟复氧过程。

2.3 转染N2a细胞 由广州锐博生物技术有限公司设计并合成Prdx1特异性siRNA及阴性对照序列，siPrdx1序列为5'-GCACCATTGCTCAGGATTA-3'。提前1 d将处于对数生长期的细胞接种在含有完全DMEM培养液的多孔板，使次日转染时细胞密度达到30%~50%。根据riboFECT CP Transfection Kit说明书，更换完全培养液为无双抗培养液，将转染试剂分别与特异性及阴性对照siRNA混合，室温孵育15 min后制备成转染复合物并加入多孔板中，轻轻混匀。将培养板置于37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度培养箱中继续培养48 h，于荧光显微镜下观察是否转染成功，并通过RT-qPCR及Western blot检测敲减效率。

2.4 CCK-8法检测细胞活力 将100µL N2a细胞悬液以每孔4 000个细胞接种到96孔板。在37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度培养箱中培养24 h。实验处理后，每孔加10µL CCK-8溶液，于37℃细胞培养箱内避光孵育2 h，用酶标仪测定450 nm处吸光度（absorbance，A），每组取6个复孔，设置无细胞空白对照孔，以正常组细胞活力为100%，实验组细胞相对活力（%）=（A实验组−A空白组）（/A对照组−A空白组）×100%。

2.5 TUNEL染色检测凋亡 取对数生长期的N2a细胞，以每孔2×104个接种于12孔板，每孔细胞悬液1 mL；培养24 h后，分组处理细胞；弃培养液，PBS洗涤1次，4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗涤1次，加入含0.3%Triton X-100的PBS，室温孵育5 min；PBS洗涤2次，将5µL TdT酶与45µL荧光标记液混合配制成50µL TUNEL检测液，加入孔中，37℃避光孵育60 min；PBS洗涤3次，加入少量DAPI染色液，覆盖住样品，室温放置5 min，吸除DAPI染色液，PBS洗涤3次；封片后立即在荧光显微镜下观察。在200倍镜下，随机取6个视野，计数呈现绿色荧光的凋亡细胞，取平均值，细胞凋亡指数=凋亡细胞数/视野下细胞总数。

2.6 RT-qPCR 按照MiniBEST Universal RNA Ex⁃traction Kit说明书操作提取各组细胞总RNA，紫外分光光度法检测总RNA纯度及浓度，取1µg RNA为模板，使用PrimeScript RT reagent Kit进行逆转录获得cDNA。使用TB Green Premix Ex TaqⅡ试剂盒进行RT-qPCR，反应总体系20µL，包括：TB Green Premix Ex TaqⅡ10µL，上、下游引物各0.8µL，cDNA溶液2µL，灭菌水6µL。反应条件：95℃30 s；95℃5 s，60℃31 s，共40个循环。Prdx1及β-actin引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。Prdx1的上游引物序列为5'-CTTCTGTCATCTGGCATG⁃GATTAAC-3'，下游引物序列为5'-AAGACTCCATA⁃ATCCTGAGCAATGG-3'，产物长度为114 bp；β-actin的上游引物序列为5'-TCAGCAAGCAGGAGTAC⁃GATG-3'，下游引物序列为5'-ACGCAGCTCAGTAA⁃CAGTCC-3'，产物长度为81 bp。采用2−ΔΔCt法计算Prdx1 mRNA的相对表达量。

2.7 Western blot 将待测细胞样品加入300µL的RIPA裂解液，充分混匀，4℃冰箱裂解2 h。于4℃、16 100×g离心10 min，取上清备用。BCA法测定蛋白浓度，取50µg总蛋白进行SDS-PAGE，再转移到PVDF膜上；5%脱脂奶粉封闭2 h，加入I抗稀释液4℃摇床孵育过夜；TBST洗膜3次，加入Ⅱ抗稀释液，室温孵育90 min；TBST洗膜3次，加入ECL试剂，曝光、显影、定影处理。以β-actin为内参照。所得条带使用Perfection V19型扫描仪（Epson）扫描，通过ImageJ软件进行灰度值分析，计算各蛋白的相对表达量。

3 统计学处理

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，采用GraphPad Prism 8.0软件绘图。实验计量资料结果以均数±标准差（mean±SD）表示。各指标数据经分析均为正态分布且方差齐，多组间数据比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用Bonferroni法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 siPrdx1转染N2a细胞的效率

1.1 荧光显微镜观察siRNA转染的有效性 以荧光基团Cy3标记的siRNA转染N2a细胞，以DAPI标记细胞核，在荧光显微镜下观察到90%以上的细胞发出明亮红色荧光，分布均匀，表明共培养48 h时siRNA可以成功转染N2a细胞，见图1。

1.2 RT-qPCR检测转染效率 以siPrdx1转染N2a细胞，48 h后提取细胞总RNA，RT-qPCR检测Prdx1的mRNA表达情况，与control组比较，转染siNC组细胞Prdx1的mRNA表达无显著差异，而转染siPrdx1组细胞Prdx1的mRNA表达显著降低（P<0.05），见图2。这一结果显示我们获得了Prdx1基因敲减的N2a细胞。

1.3 Western blot检测转染效率 以siPrdx1转染N2a细胞，48 h后提取细胞总蛋白，Western blot检测Prdx1蛋白表达情况，与control组比较，转染siNC组细胞Prdx1蛋白表达无显著差异，而转染siPrdx1组细胞Prdx1蛋白表达显著降低（P<0.05），见图3。这从蛋白水平进一步证明我们获得了Prdx1基因敲减的N2a细胞。

2 Prdx1敲减对OGD/R诱导的N2a细胞活力的影响

CCK-8结果显示，与control组比较，OGD/R处理组N2a细胞活力显著降低（P<0.05）；OGD/R处理后，转染siNC组N2a细胞活力与单纯OGD/R处理组比无显著差异，而转染siPrdx1组N2a细胞的活力进一步降低（P<0.05），见图4。

Figure 1.The fluorescence images of N2a cells transfected with siRNA for 48 h.The red fluorescence represents the N2a cells that have been successfully transfected with Cy3-labeled siRNA.The blue fluorescence represents the nuclei of all N2a cells stained with DAPI.The scale bar=50µm.图1 siRNA转染N2a细胞48 h的荧光图片

Figure 2.The transfection efficiency of siPrdx1 in N2a cells was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group.图2 RT-qPCR检测siPrdx1转染N2a细胞的效率

3 Prdx1敲减对OGD/R诱导的N2a细胞凋亡的影响

TUNEL荧光染色结果显示，与control组比较，OGD/R处理组凋亡N2a细胞的数目显著增多（P<0.05）；OGD/R处理后，转染siNC组凋亡N2a细胞的数目与单纯OGD/R处理组比较无显著差异，而转染siPrdx1组凋亡N2a细胞的数目进一步增多（P<0.05），见图5。

Figure 3.The transfection efficiency of siPrdx1 in N2a cells was detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group.图3 Western blot检测siPrdx1转染N2a细胞的效率

Figure 4.The effect of Prdx1 gene knockdown on the viability of N2a cells induced by OGD/R.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/Rgroup.图4 Prdx1敲减对OGD/R诱导的N2a细胞活力的影响

4 Prdx1敲减对OGD/R诱导的N2a细胞JNK/cas⁃pase-3通路的影响

Western blot结果显示，与control组比较，OGD/R处理组的Prdx1、p-JNK和cleaved caspase-3蛋白水平均显著升高（P<0.05）；OGD/R处理后，转染siNC组的Prdx1、p-JNK与cleaved caspase-3蛋白水平与单纯OGD/R处理组比较均无显著差异，而转染siPrdx1组的Prdx1蛋白表达显著降低，同时p-JNK和cleaved caspase-3蛋白水平均进一步升高（P<0.05），表明Prdx1基因敲减进一步促进了OGD/R诱导的N2a细胞中JNK和caspase-3的激活，见图6。

Figure 5.The effect of Prdx1 gene knockdown on the apoptosis of N2a cells induced by OGD/R.The apoptosis of N2a cells was de⁃tected by TUNEL assay.The green fluorescence represents the apoptotic N2a cells stained by TUNEL.The blue fluores⁃cence represents the nuclei of all N2a cells stained with DAPI.The scale bar=50µm.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/Rgroup.图5 Prdx1敲减对OGD/R诱导的N2a细胞凋亡的影响

Figure 6.The effect of Prdx1 gene knockdown on JNK/caspase-3 pathway in the N2a cells induced by OGD/R.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/Rgroup.图6 Prdx1敲减对OGD/R诱导的N2a细胞JNK/caspase-3通路的影响

5 OGD/R诱导的N2a细胞凋亡与JNK/caspase-3通路的关系

TUNEL荧光染色结果显示，OGD/R处理后，应用SP600125组凋亡N2a细胞的数目与单纯OGD/R处理组比较显著减少（P<0.05），见图7A。

Western blot结果显示，OGD/R处理后，应用SP600125组N2a细胞中p-JNK和cleaved caspase-3蛋白水平与单纯OGD/R处理组比较均显著降低（P<0.05），见图7B。

6 Prdx1通过JNK/caspase-3通路影响OGD/R诱导的N2a细胞凋亡

TUNEL荧光染色结果显示，转染siPrdx1后，与单纯OGD/R处理组相比，同时应用SP600125可显著减少凋亡N2a细胞的数目（P<0.05），见图8A。

Western blot结果显示，转染siPrdx1后，与单纯OGD/R处理组相比，同时应用SP600125使p-JNK和cleaved caspase-3蛋白水平均显著降低（P<0.05），见图8B。

Figure 7.OGD/R-induced N2a cell apoptosis was mediated by JNK/caspase-3 pathway.A：the apoptosis of N2a cells was detected by TUNEL assay（scale bar=50µm）；B：the protein levels of p-JNK，JNK and cleaved caspase-3 in N2a cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/Rgroup.图7 JNK/caspase-3通路介导OGD/R诱导的N2a细胞凋亡

讨 论

脑缺血再灌注之后，氧供改善，脑组织内活性氧自由基呈爆发式增长，打破了氧化与抗氧化之间的平衡，对脑组织造成不可逆损伤［8］。活性氧自由基可能通过直接损伤DNA、诱发生物膜脂质过氧化、改变部分关键酶的活性以及影响核基因的转录表达等多种途径诱发细胞凋亡。小鼠脑神经母细胞瘤N2a细胞具有神经干细胞特征，有分化为类神经元的潜能，易于转染且大量表达微管蛋白，常被用作阿尔兹海默症、神经生长及再生和神经毒性等病理生理机制研究的对象［9］。本研究显示，氧糖剥夺8 h后复糖复氧24 h处理的N2a细胞活力降低，凋亡数目增多，同时伴随凋亡执行蛋白cleaved caspase-3表达升高，提示OGD/R模型制备成功。

Prdx1属于典型2-Cy2 Prdx家族中的一员，在哺乳动物各器官组织中广泛表达，对维持体内ROS水平发挥着重要的作用，并通过调控蛋白激酶的氧化还原状态，参与细胞增殖、分化和凋亡等方面的信号转导过程［10-11］。与Wu等［5］的研究一致，Wang等［12］研究对OGD/R后大鼠大脑星形胶质细胞行蛋白表达分析，结果显示OGD/R后Prdx1-4表达量均显著升高。在对大鼠脑出血模型的研究中显示，血肿周围脑组织Prdx1表达显著升高，将腺相关病毒Prdx1表达载体注射到大鼠纹状体3周后，构建脑出血模型，显示Prdx1过表达后血肿周围脑组织Bcl-2/Bax增加，神经细胞凋亡减少，表明Prdx1与细胞凋亡密切相关［13］。本实验通过转染siPrdx1，表明抑制Prdx1表达使OGD/R处理后的N2a细胞活力进一步降低，并加剧了细胞凋亡。这些结果提示Prdx1可能对保护OGD/R后的N2a细胞起着重要的作用。本研究进一步探讨Prdx1基因敲减促进OGD/R诱导的N2a细胞凋亡的可能机制。

Figure 8.Prdx1 affected OGD/R-induced N2a cell apoptosis through JNK/caspase-3 pathway.A：the apoptosis of N2a cells was de⁃tected by TUNEL assay（scale bar=50µm）；B：the protein levels of p-JNK，JNK and cleaved caspase-3 in N2a cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs OGD/R group；△P<0.05 vs OGD/R+siPrdx1 group.图8 Prdx1通过JNK/caspase-3通路影响OGD/R诱导的N2a细胞凋亡

JNK信号通路参与细胞增殖、分化、形态维持、骨架构建、凋亡、DNA损伤修复等多种生物学过程［14］。MCAO和OGD/R损伤条件下均可上调神经元p-JNK与cleaved caspase-3的表达水平［15-16］。本研究同样检测到OGD/R处理能够诱导N2a细胞p-JNK与cleaved caspase-3表达水平升高。Lv等［17］研究表明，在小鼠急性肺损伤模型中，Prdx1基因敲除可通过提高ROS水平加重氧化应激和肺损伤，并激活JNK信号通路。由此，我们推测Prdx1对JNK信号通路存在某种调控关系，本研究结果显示，Prdx1基因敲减可显著上调OGD/R处理后N2a细胞中p-JNK与cleaved caspase-3的表达水平，这表明Prdx1基因敲减促进OGD/R诱导的N2a细胞凋亡可能与JNK/caspase-3通路活性进一步激活有关。

SP600125是一种小分子JNK抑制剂，可有效阻断JNK信号通路的激活［18］。为进一步验证JNK激活是否为Prdx1基因敲减促进N2a细胞凋亡所必须的，我们应用了SP600125，结果表明，与单独Prdx1基因敲减组的N2a细胞相比，SP600125处理降低了N2a细胞的凋亡率以及p-JNK与cleaved caspase-3表达水平，这进一步证实Prdx1基因敲减是通过JNK/cas⁃pase-3通路促进OGD/R诱导N2a细胞凋亡。

综上所述，本研究表明，Prdx1可通过调控JNK/caspase-3通路影响OGD/R诱导的N2a细胞凋亡。这进一步支持了Prdx1可能作为一种内源性保护因子参与了脑缺血再灌注损伤的病理生理过程。