桦褐孔菌醇提物对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

付雯雯，刘学莹，崔贺铭，张玉莹，于 萍，李沅耕，邬 丹，高 洋，武 毅*

（1.吉林大学药学院，长春 130021；2.日本国神奈川县川崎市纳米医疗创新中心，川崎 210-0821）

心肌缺血是一种具有高发病率和高病死率的心血管疾病，重建血液供应是治疗心肌缺血的主要手段，但血流恢复过程中产生的严重刺激进一步加重了心肌损伤[1]，可能导致患者产生心肌顿挫和心律失常等，发生心肌缺血再灌注（MI/R）损伤的病理现象[2]。研究[3-4]表明，心肌缺血再灌注损伤的发生可能与MI/R过程中产生大量活性氧及其引起的氧化应激、钙超载和心肌细胞凋亡和炎症等有关。因此，有效缓解心肌缺血再灌注损伤具有重要意义。桦褐孔菌（inonotus obliquus）是一种生长在白桦树上的可食用真菌，其主要生物活性成分为多糖、多酚、黑色素和三萜等[5]。研究[6-7]显示桦褐孔菌具有抗肿瘤、降血脂、调节代谢紊乱和抗氧化等作用，但桦褐孔菌在心肌缺血再灌注损伤中的作用研究较少。本实验旨在探究桦褐孔菌醇提物对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响，并初步探讨其潜在的保护作用机制。

1 资料与方法

1.1 试剂与仪器

桦褐孔菌（inonotus obliquus）采集自吉林省；AST试剂盒、LDH试剂盒、CK-MB试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒、GSH-px试剂盒和CAT试剂盒购自南京建成生物工程研究所。彩色多普勒超声便携机GE Vivid I（GE Healthcare），电热鼓风干燥箱101A-3E（上海实验仪器厂有限公司），电子天平ALC-10.4（上海精密科学仪器公司），离心机TDL-40B（上海安亭科学仪器厂），高速低温离心机D37520（Heraeus）；制冰机SIM-F140（SANYO），低温冰柜U570（NBS），酶标仪PC384（Molecular Devices），电动玻璃匀浆机DY89-I（宁波新芝科器研究所）。

1.2 实验动物

雌性健康Wistar大鼠125只，体质量230～250 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，合格证号：SCXK（辽）-2015-0001。

1.3 桦褐孔菌醇提物制备

精密称重桦褐孔菌2 500 g，在室温下浸入12.5 L蒸馏水中过夜，在80 ℃下提取2.5 h，再通过3层纱布过滤后收集上清液，重复2次。旋转蒸发浓缩滤液，然后在60 ℃下干燥，压碎过80目筛子以获得初提物。将初提物加入12.5 L 95%乙醇，在75 ℃下提取2.5 h。通过3层纱布过滤收集上清液，重复萃取2次。收集滤液并旋转蒸发浓缩，然后在60 ℃下干燥，压碎并过80目筛子以获得桦褐孔菌醇提物备用。

1.4 实验分组

将Wistar大鼠随机分为5组：假手术组，模型组，桦褐孔菌醇提物150、300、600 mg·kg-1剂量组，每组25只大鼠。假手术组和模型组大鼠每天灌胃给予0.5% CMC-Na，桦褐孔菌醇提物组大鼠每天灌胃给予相应剂量的桦褐孔菌醇提物，每天1次，连续给药7 d。

1.5 模型建立方法

各组大鼠末次给予桦褐孔菌乙醇提取物1 h后，进行手术操作：将大鼠麻醉后，固定在手术台上进行开胸，使大鼠心脏暴露，于其下2 mm处，用0号手术线对各组大鼠冠状动脉左前降支进行结扎，结扎2 h后，拉松结扎线，进行再灌注2 h，建立MI/R模型，对于假手术组大鼠，只进行手术操作，不进行结扎。MI/R模型建立成功后，检测大鼠心脏功能、心肌梗死面积、血液生化学等相关指标。

1.6 观察指标

1.6.1 心脏功能检测 再灌注2 h后，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠。应用彩色多普勒超声便携机检测大鼠心脏功能相应指标。各指标参数以双盲方式进行测量，测量结果为连续3个心动周期的平均值。

1.6.2 心肌梗死面积检测 再灌注2 h后，处死大鼠剖取心脏，测定心肌梗死面积。用生理盐水对大鼠心腔进行清洗，切除心房，对左心室湿重进行称量，再将左心室进行切片，将切片样本放置于0.5%NBT磷酸缓冲液中浸没，在37 ℃水浴条件下孵育20 min。染色结束后取出切片标本进行观察。心肌梗死的面积百分比计算=缺血心肌组织重/左心室湿重×100%。

1.6.3 心肌三酶的测定 再灌注2 h后，采集大鼠腹主动脉血1 mL，将血液样本静置2 h后，用离心机以2 000 r·min-1进行离心，10 min后分离出血清。按照试剂盒说明书的方法检测大鼠血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）及乳酸脱氢酶（LDH）活性。

1.6.4 心肌组织中氧化应激指标测定 再灌注2 h，采血结束后，取出大鼠心脏用于进行大鼠心肌组织匀浆的制备。用预冷生理盐水反复清洗大鼠的心肌组织，将残留的血液去除后，将心肌组织用滤纸拭干，进行称质量。在样本中加入生理盐水，在低温条件下用玻璃匀浆机获取匀浆样本。用离心机进行离心，转速为3 500 r·min-1，时间为15 min，移取上清液分装至洁净的EP管中，在-80 ℃的环境下保存。样本制备完成后，按照试剂盒说明书的方法检测心肌组织中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）活性和丙二醛（MDA）含量。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0 进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用Student’st-test，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心脏功能比较

见表1。

表1 各组大鼠心脏功能比较（±s，n= 8）

表1 各组大鼠心脏功能比较（±s，n= 8）

注：与假手术组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别 剂量/（mg·kg-1） LVIDd/mm LVIDs/mm LVEF/% LVFS/%假手术组 — 4.00±0.54 2.50±0.54 85.63±3.66 48.88±5.89模型组 — 6.25±1.16## 4.38±0.52## 51.75±6.39## 24.13±5.00##桦褐孔菌醇提物组150 5.25±0.46△ 3.63±0.52△ 63.25±4.83△△ 31.50±4.34△△300 5.13±0.83△ 3.50±0.53△△ 70.13±4.76△△ 37.25±5.06△△600 5.00±0.76△ 3.38±0.52△△ 72.38±4.27△△ 39.13±5.19△△

2.2 各组大鼠血清中CK-MB、AST和LDH活性比较

见表2。

表2 各组大鼠血清中CK-MB、AST和LDH活性比较（±s，n= 10）

表2 各组大鼠血清中CK-MB、AST和LDH活性比较（±s，n= 10）

注：与假手术组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01

组别剂量/（mg·kg-1）CK-MB/（ng·mL-1）AST/（U·L-1）LDH/（U·L-1）假手术组 — 74.40±9.51 27.66±3.13 11 472.22±881.40模型组 — 130.98±13.97## 67.04±5.39## 15 144.22±509.96##桦褐孔菌醇提物组150 92.62±12.81△△ 52.39±7.34△△ 13 581.09±672.32△△300 80.78±12.36△△ 48.19±8.05△△ 13 329.67±835.27△△600 77.15±12.45△△ 41.79±7.12△△ 13 071.21±663.15△△

2.3 各组大鼠心肌组织中MDA含量和SOD、CAT、GSH-px活性比较

见表3。

表3 各组大鼠心肌组织中MDA含量和SOD、CAT、GSH-px活性比较（±s，n= 10）

表3 各组大鼠心肌组织中MDA含量和SOD、CAT、GSH-px活性比较（±s，n= 10）

注：与假手术组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01

组别 剂量 /（ mg·kg-1） MDA/（nmol·mgprot-1） SOD/（U·mgprot-1） CAT/（U·mgprot-1） GSH-px/（U·mgprot-1）假手术组 — 1.40±0.24 321.97±55.66 3.82±0.56 7.99±0.95模型组 — 2.60±0.29## 237.05±30.75## 2.66±0.24## 4.35±0.64##桦褐孔菌醇提物组150 2.06±0.19△△ 279.94±50.61△ 3.21±0.48△△ 6.69±0.94△△300 1.74±0.37△△ 289.28±26.50△△ 3.61±0.53△△ 6.79±1.59△△600 1.70±0.38△△ 295.10±38.85△△ 3.68±0.46△△ 7.03±0.86△△

2.4 各组大鼠心肌梗死面积比较

见表4。

表4 各组大鼠心肌梗死面积比较（±s，n= 10）

表4 各组大鼠心肌梗死面积比较（±s，n= 10）

注：与假手术组比较，## P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01

组别 剂量 /（mg·kg-1） 梗死面积/%假手术组 — 0.00±0.00模型组 — 38.13±4.72##桦褐孔菌醇提物组150 25.42±5.69△△300 22.56±4.20△△600 21.07±5.26△△

3 讨论

再灌注是临床上治疗心肌缺血的有效手段，然而在心肌缺血再灌注过程中，心肌细胞经历了缺氧/复氧及PH突然变化，血管阻塞，导致氧化应激等现象发生，从而诱导心肌细胞发生凋亡，对心脏结构造成破坏[8]。因此，开发新的治疗药物以减少再灌注过程对心肌组织产生的进一步损伤具有重要的理论和现实意义。近年来，从传统医药中发现新型治疗药物成为研究热点，研究[9-10]表明传统医药在对抗心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用。桦褐孔菌是生长在西伯利亚的可食用真菌，早在16世纪就开始被用来防治多种疾病。研究[11-12]发现，其有良好的抗氧化、抗炎等药理作用。研究[13]表明，桦褐孔菌能有效抑制心肌细胞的凋亡，提高心肌细胞活力。研究结果显示，与模型组比较，桦褐孔菌醇提物各剂量组能明显改善大鼠心脏功能，减小心肌梗死面积，表明桦褐孔菌醇提物在缺血再灌注过程中对心肌组织具有保护作用。

在心肌缺血再灌注过程中，产生大量的活性氧，导致机体氧自由基的产生和清除的平衡被打破，使得机体进入氧化应激状态，对心肌造成损伤[14-15]。氧化应激状态下，大量的氧自由基会导致脂质过氧化对膜磷脂造成损坏，对心肌细胞膜完整性造成破坏，使心肌酶从胞内漏出。因此血清中的心肌酶的活性水平可以反映心肌细胞受损的程度[16-17]。在氧化应激条件下，发生脂质过氧化反应，并最终产生MDA[18]。MDA是脂质过氧化的标志物，它可以进一步引起蛋白质，核酸和其他生物大分子的交联聚合，从而进一步损害细胞，同时它的含量也用作反应氧化应激程度的指标[19]。SOD、CAT、GSH-px是机体的抗氧化酶，可以清除体内的氧自由基，其活性水平代表了机体清除氧自由基及对抗氧化应激的能力[20]。本研究结果显示，与模型组比较，桦褐孔菌醇提物各剂量组能显著降低血清中CK-MB、AST和LDH活性，同时降低SOD、CAT、GSH-px活性，增强MDA含量，表明桦褐孔菌醇提物可以抑制氧化应激产生的脂质过氧化，并增强机体氧自由基的清除能力。

综上所述，桦褐孔菌醇提物可以对抗心肌缺血再灌注损伤过程中产生的氧化应激反应，增强心肌细胞对氧自由基的清除能力，对心肌细胞起保护作用。