基于高通量测序技术探究加味二陈汤对肥胖大鼠肠道微生物组的影响

杜 恒

（武汉市中西医结合医院儿科，武汉 430022）

随着人类工业文明发展，人们生活水平提高，儿童肥胖率呈逐年上升趋势。据相关研究表明，2014年我国7～18岁儿童肥胖与超重总检出率高达19.4%。肥胖会引起儿童心血管系统、呼吸系统等多个系统疾病，还会对儿童心理、骨骼以及肝脏等产生影响[1-3]。据相关实验表明，阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征等也与肥胖有着密不可分的联系[4-5]。鉴于单纯性肥胖对我国儿童健康的巨大威胁，且西药减肥药存在的对儿童健康的未知影响，本课题组从5年前开始针对中药减肥展开了一系列的研究。加味二陈汤为研究成果之一，是武汉市中西医结合医院儿科徐辉甫主任医师的经验方，其主要功效是运脾和胃，燥湿化痰，可治疗以痰浊中阻为主要证候的单纯性肥胖。本实验借助小窝喂养诱导肥胖幼鼠模型，对其进行加味二陈汤灌胃，实验结果表明，治疗后小窝喂养肥胖幼鼠体质量、Lee’s 指数、胆固醇、三酰甘油及游离脂肪酸等指标具有明显改变[6-7]。本文通过高通量测序技术，进一步研究加味二陈汤对肥胖大鼠肠道微生物组的影响，从分子生物学水平分析治疗小儿单纯性肥胖采用加味二陈汤的应用价值。

1 材料和方法

1.1 肥胖大鼠模型建立及分组

从湖北实验动物研究中心购买成年SPF级SD大鼠雌性10只，雄性5只（根据2:1比例使其交配并自然分娩）。将出生后的雄性大鼠分为大窝组与小窝组，其中大窝组每只母鼠哺乳10只雄鼠，小窝组每只母鼠哺乳3只雄鼠。给予哺乳母鼠常规饮食，并在大鼠出生21 d后断奶，将小窝喂养后的肥胖幼鼠（体质量≥大窝组体质量均值+1.4倍标准差）随机分成2组：加味二陈汤组（予加味二陈汤灌胃）与对照组（予生理盐水灌胃），均以标准饲料喂养。

1.2 药物

治疗组方：法半夏、苍术、生山楂、茯苓、决明子、陈皮、甘草，由四川新绿色药业科技发展有限公司提供中药颗粒剂。

1.3 给药方法

参照5岁儿童生理体质量确定大鼠灌胃剂量，大鼠剂量与人剂量等效。治疗组采用加味二陈汤灌胃，时间为5周，直至处死；对照组采用生理盐水灌胃，时间为5周，直至处死。

1.4 粪便收集、测序及DNA提取

灌胃后采集大鼠肠道微生物样品。固定大鼠后，在肛门周围涂抹75%乙醇刺激其排便。用无菌棉签涂抹粪便后，放入10 mL无菌EP管中，快速放入干冰箱，-80℃冰箱中保存待后续送实验室。样本送到上海美吉生物公司进行抗微生物DNA的提取，PCR扩增细菌的16 s区域后，采用Hiseq 2 500平台进行高通量测序。

1.5 统计学方法

采用Vsearch算法，将相似性大于97%的序列读数定为一个OTU（operational taxonomic units）。对于相似度水平的OTU代表序列采用RDPclassifier贝叶斯算法进行分类学比对分分析。2组大鼠肠道微生物组在门（phylum）和属（genes）水平上的丰度，采用t检验评估。以P＜0.05表示差异有统计学意义。最后采用LEfSe分析，比较组间菌群差异，找出各组间差异的微生物种类。

2 结果

2.1 测序原始数据分析

通过高通量测序，2组大鼠共12个样本，共获得了340 263条高质量的序列读数，占总序列的96.86%，序列平均长度为300～500 bp。各组样本数据分析结果，见表1。

表1 序列数据统计（±s）

表1 序列数据统计（±s）

分组 Raw tags均数 Valid tags均数 Valid tags均数百分比/%对照组 32 273±3 632 23 718±2 689 73.51±2.57加味二陈汤组 43 818±6 000 34 848±5 025 79.15±5.72

2.2 2组大鼠肠道微生物多样性探究

对照组与加味二陈汤组大鼠肠道菌群多样性分析结果显示：1）加味二陈汤灌胃导致大鼠肠道菌群特有的OTU减少。2）对照组的肠道菌群均匀度低于加味二陈汤组，说明加味二陈汤组的肠道菌群物种丰富度较高。3）对照组和加味二陈汤组大鼠Shannon指数相近，但经t检验差异无统计学意义（P＞0.05）。4）对照组的Simpson指数高于加味二陈汤组，且t检验存在统计学意义（P＜0.05），表明加味二陈汤组肠道菌群生物多样性高于对照组。5）加味二陈汤组大鼠的Chao1指数较对照组高，数据结果具有统计学意义（P＜0.05），说明加味二陈汤对肠道微生物群落具有改善作用。

2.3 2组大鼠菌群差异探究

通过物种分析，研究对照组和加味二陈汤组大鼠肠道菌群的组成。2组中肠道菌群相对较高的前12门见表2。从表中可以看出，在2组大鼠的粪便样本中，12个门中有9个门出现。但经t检验，大部分门的差异均不具有统计学意义，只有螺旋菌门、柔性菌门2组间差异具有统计学意义。加味二陈汤组大鼠肠道菌群中仅存在疣状微菌和螺旋菌，其Mean丰度分别为（0.010±0.013）%、（0.010±0.014）%、（0.010±0.005）%。

表2 2组大鼠肠道菌群组成中主要门的相对丰度

研究结果显示，菌属水平对照组和治疗组大鼠肠道菌群的组成。1）对照组和加味二陈汤组肠道菌群丰度最高的三个门分别是厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门。对照组和加味二陈汤组肠道菌群丰度在细菌在属水平上的差异，其中对照组菌群排名前3的是毛霉、紫色单孢子菌和乳酸菌。2）加味二陈汤组大鼠中丰度较高的前3种细菌分别为瘤胃菌、毛霉菌和紫色单孢子菌。在细菌属的分类水平上，2组大鼠的肠道菌群有统计学差异，如瘤胃细菌、螺杆菌、副杆菌、真细菌、布鲁氏菌、梭菌等。

2.4 2组大鼠肠道菌群LEfSe差异分析

对照组和加味二陈汤组大鼠肠道微生物的LEfSe多级物种层级树图结果显示：2组之间特定细菌门的差异主要表现在厚壁菌门、变形菌门和柔性膜菌门的丰度上。结合统计学分析，加味二陈汤组大鼠肠道微生物多样性高于对照组。

3 讨论

单纯性肥胖是指由于卡路里摄入量超出利用与消耗量，导致脂肪在体内不断积累，体质量超标，不产生器质性病变的肥胖[8-10]。西医治疗单纯性肥胖主要以健康教育、改善生活方式、坚持体育锻炼、药物以及手术等方式[11-12]。中医学认为，儿童单纯性肥胖主要与饮食不节有关。《素问·通评》中指出：“甘肥贵人，则膏梁之疾也。”儿童由于暴饮暴食以及忙于学习而忽视体育锻炼致使肥胖发生[13-14]。《素问宣明正气论》有“久坐伤气，久坐伤肉”的描写，《丹溪治法必要》有“肥人多痰”“肥人多湿”的论述。中医学认为，饮食不节，脾失健运，运化失施导致小儿肥胖。彭真等[15]研究发现，儿童单纯型肥胖主要病机与病理发展转归的重要因素与痰湿有关。我院儿科徐辉甫教授在治疗儿童单纯性肥胖方面以加味二陈汤为经验方，通过多年临床验证，治疗效果较好，不易反弹，并且副作用较小。治疗组方在二陈汤基础上加生山楂、决明子、苍术。二陈汤出自《太平惠民和剂局方》，主要功效是理气和中、化痰燥湿，属于治疗痰湿证经典方。《丹溪心法附余》指出： “此方半夏豁痰燥湿，橘红消痰利气，茯苓降气渗湿，甘草补脾和中。”加味二陈汤在二陈汤原方的基础上增加生山楂健胃消脂，降低血清中的胆固醇[16]，增加决明子清肝祛湿，调节体内葡萄糖和脂肪代谢[17]，另加苍术加强运脾燥湿之功，理气燥湿化痰治标的同时，运脾健脾截生痰之源兼顾治本。在本课题组的前期研究中，加味二陈汤在改善小窝喂养肥胖幼鼠的血脂代谢，减轻体质量和降低 Lee’s 指数等方面获得了很好的效果。

肠道内微生物主要依靠动物肠道生活，并帮助寄主完成诸多生理功能[18-19]。肠道具有消化吸收的作用，是人体最大的免疫器官，能够维持人体正常免疫防御功能。微生物是人体内最复杂、最庞大的微生态系统，人体肠道是其主要生长环境，其本身以及代谢产物除能够调节人体健康外，还可以沟通膳食与宿主之间的关系。基于此，本研究在分析加味二陈汤的减肥功效时，亦探讨加味二陈汤对人体肠道微生物的相关影响。

根据高通量测序结果显示，加味二陈汤组大鼠肠道微生物多样性高于对照组，而肠道生物多样性可协助宿主进行能量吸收与储存[20]。加味二陈汤可能通过调控肠道微生物组来达到减肥效果。埃希氏菌属是条件菌，通常情况下不致病，但是如果发生特殊情况，会导致宿主腹痛或者腹泻[21]。本研究中服用了加味二陈汤大鼠埃希氏菌属丰度要明显高于对照组，可见加味二陈汤可通过促进排泄降低体质量。值得注意的是，颤螺菌属和乳杆菌菌属都属于益生菌，在宿主对食物的消化中起着必不可少的作用[22]，加味二陈汤组大鼠肠道中的相对丰度要少于对照组。本研究发现，加味二陈汤的使用导致了肥胖大鼠的肠道微生物多样性明显升高，其中一些和食物消化相关的菌属丰度发生了改变，但是这些改变对于宿主健康的影响是未知的，值得我们更进一步的研究。本课题组未来的探索中，会考虑使用更多的大鼠进行实验，并且设置空白对照组，使实验的结果更有说服力。