血清中microRNA对非小细胞肺癌早期转移潜在的诊断价值

蔡 睿，王振兴，安 南，贺云靖，杨文卓，王 星，许哲男*

（1.吉林大学临床医学院，长春 130012；2.吉林大学中日联谊医院胸外科，长春 130033）

肺癌是呼吸系统常见的一种恶性肿瘤，其发病率和致死率已经成为世界范围内的公共卫生问题[1]。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中常见的一种分型[2]。随着诊疗技术的发展和改进，NSCLC的总体生存率有所提升，但其5年生存率仍处于较低水平[3]。目前NSCLC发生早期远处转移的分子机制尚不清楚，研究[4]发现，外泌体介导的细胞间信号传导在肿瘤转移过程中发挥重要作用。本研究主要通过对NSCLC转移和非转移患者血清外泌体进行提取、分离、测序以及实验验证的方式，阐述血清中微小RNA（miRNA）对NSCLC早期转移潜在的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 外泌体提取和分离

随机收集就诊于我院胸外科的2例NSCLC转移患者全血10 mL，2例NSCLC未转移患者全血10 mL以及2例健康体检患者全血10 mL。同期选取30例NSCLC转移患者和30例NSCLC未转移患者进行实时定量聚合酶链式反应验证基因芯片准确性。4℃下1 900 g离心10 min，搜集上层血浆并在4℃下3 000 g离心15 min，搜集上清液进行外泌体提取。提取方法选择超高速离心法，即3 00 g条件下离心10 min，搜集上清并进行2 000 g条件下离心10 min，搜集上清并进行10 000 g条件下离心30 min，搜集上清并进行100 000 g条件下离心70 min，最终沉淀物即为外泌体。

1.2 外泌体的基因芯片测序

TRIzol法提取6例样本外泌体中的RNA，应用NanoDrop ND-1000进行RNA浓度和纯度的检测。用含T4连接酶的cyanine 3-pCp标记miRNA，通过浓缩和干燥标记的cRNA然后被重悬。在11 uL体积10×阻断剂和2.2 uL的25×裂解缓冲液中培养30 min并添加55 uL杂交缓冲液，最终清洗、固定和扫描。

1.3 外泌体测序结果验证

随机选取就诊于我院的30例NSCLC转移患者和30例NSCLC未转移患者，取全血10 mL，进行外泌体的分离和提取。外泌体应用蛋白电泳和电子显微镜进行检测。应用百泰克miRNA提取试剂盒进行外泌体中miRNA的提取，应用吉玛miRNA逆转录试剂盒以及实时定量聚合酶链式反应试剂盒对差异表达的miRNA进行实验验证。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 NSCLC患者血清外泌体中RNA质量检测

见表1，图1。

表1 外泌体中RNA浓度和纯度的检测

图1 外泌体中RNA质量以及芯片检测

2.2 NSCLC患者血清外泌体miRNA芯片检测结果

见图2。

图2 血清外泌体miRNA芯片检测

2.3 外泌体差异表达miRNA检测结果

见图3，表2。

图3 血清外泌体鉴定

表2 血清外泌体miRNA芯片实时定量聚合酶链式反应结果（±s，n= 30）

表2 血清外泌体miRNA芯片实时定量聚合酶链式反应结果（±s，n= 30）

注：与腺癌转移比较，# P＜ 0.05

样本 腺癌转移（CT值）腺癌未转移（CT值） 差异倍数miR-4436a 32.80±2.75 34.52±3.52# 2.11 miR-4687-5p 33.06±2.88 34.79±3.33# 2.09 miR-22-3p 31.96±1.05 31.41±1.02# 0.43 miR-3666 31.00±1.25 30.36±1.12# 0.41 miR-4448 33.05±1.45 32.36±1.18# 0.39 miR-4449 32.81±0.99 32.35±0.58# 0.46 miR-6751-5p 31.78±0.69 31.29±0.88# 0.45 miR-92a-3p 30.37±0.86 29.74±1.03# 0.41

3 讨论

外泌体是一种纳米级别的双层膜结构，其内包含有大量的生物活性物质如蛋白质、脂质和核酸[5]。外泌体可以由各种活细胞分泌，并被靶细胞摄取，完成细胞间的生物信息传递以及调控。近年来研究发现，外泌体可能参与肺癌特别是NSCLC的远处转移。另外，外泌体广泛分布于血液、尿液、脑脊液以及胸水中[4]，这就为其成为诊断标志物提供便利条件。故本文通过对NSCLC患者血清中外泌体的提取、分离、测序以及验证发现，血清外泌体中miR-4436a，miR-4687-5p，miR-22-3p，miR-3666，miR-4448，miR-4449，miR-6751-5p，miR-92a-3p可以作为NSCLC远处转移的诊断标志物。

微小RNA（miRNA）是一种长度大约为22 nt的非编码RNA，被认为可能参与到多种肿瘤的生长和远处转移的病理学过程[6]。血液中游离的miRNA较易受到酶的分解，因此直接检测血液中游离的miRNA误差较大，很难作为临床诊疗标志物进行广泛开展[7]。外泌体具有双侧脂质结构，能够有效的保护其内搭载的miRNA不被血液中酶分解。因此检测血液外泌体中的miRNA可能对NSCLC远处转移提供早期的诊断信息[8-9]，进而指导临床治疗。

既往文献报道肺癌外泌体可能参与肺癌细胞的快速增殖、远处转移、放射性抵抗以及药物抵抗等病理生理学过程。研究[10]发现外泌体中miR-1247-3p诱导癌相关成纤维细胞活化进而促进肝癌细胞肺转移。研究[11]发现缺氧诱导肺癌细胞分泌的包含miR-23a的外泌体可以通过靶向紧密连接蛋白ZO-1增加新生血管生成和血管通透性，进而促进肺癌的转移。研究[12]通过对NSCLC远处转移和未转移患者血清中外泌体进行miRNA基因芯片检测发现miR-4448可能参与NSCLC的早期转移。研究[13]发现外泌体中长链非编码RNA-MMP2-2能够通过靶向调控MMP2的表达进而促进肺癌细胞的侵袭和远处转移。

本研究通过对4例NSCLC患者血清中外泌体测序，发现NSCLC发生转移的患者血清外泌体中miR-4436a，miR-4687-5p呈现差异性上调表达，miR-22-3p，miR-3666，miR-4448，miR-4449，miR-6751-5p，miR-92a-3p呈现差异性下调表达，提示这8种外泌体中miRNA对NSCLC早期转移具有潜在的诊疗价值。miRNA基因芯片能够快速检索样本中差异表达的miRNA，速度快、成本低，但是其准确性尚需要结合实时定量聚合酶链式反应实验进行验证。因此，我们通过吉玛公司进行上述8种引物的合成，并通过实时定量聚合酶链式反应实验在10例NSCLC未转移以及NSCLC转移的患者血液外泌体中进行验证，最终确认这8种外泌体中的miRNA发生差异性表达，和基因芯片检测结果一致。

综上所述，肺癌患者血清外泌体中miR-4436a，miR-4687-5p呈现差异性上调表达，miR-22-3p，miR-3666，miR-4448，miR-4449，miR-6751-5p，miR-92a-3p呈现差异性下调表达，检测这8种血清标志物可以对NSCLC的早期远处转移起到提示作用，指导临床药物治疗。但本研究尚有一定的局限性，测序样本较少可能存在结果偏倚，更大样本的测序以及更多样本的实验验证应该在后续研究中继续开展。