多发性骨髓瘤循环肿瘤浆细胞的免疫表型特征及其临床意义*

蔡梦洁 梅仁 戴兰 沈文红 傅琤琤 朱明清

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一类克隆性浆细胞异常增殖的恶性血液疾病，发病率位于血液系统的第二位，其临床表现差异较大，预后具有显著异质性。近年来，越来越多的研究者对MM患者外周血中循环肿瘤浆细胞（circle tumor plasma cell，CTPC）、肿瘤细胞DNA和RNA以及标志蛋白的监测开展了广泛研究[1，2]。与骨髓检测相比，CTPC具有以下三个优势：①CTPC的检测侵袭性小，无显著创伤；②由于外周血稀释以及骨髓瘤细胞的灶性分布，骨髓标本浆细胞比例准确性不高，CTPC绝对计数更为精准；③在MM诊断中，CTPC与骨髓瘤负荷具有相关性[1，3]。研究表明CTPC是MM的一个独立可靠的预后指标，对MM的诊断、判断预后及复发具有重要意义。但是，关于MM患者CTPC免疫表型的研究甚少。本研究主要通过对CTPC与骨髓检测结果的比较，探讨CTPC数量和免疫表型在MM临床评估中的意义。

对象与方法

1 研究对象 选取2016年12月～2020年8月苏州大学附属第一医院血液科初诊为多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的患者75例，中位年龄为58岁，男41例，女34例，诊断符合我国国内MM诊断标准。其中，CTPC–组为15例，中位年龄为58岁，男9例，女6例；CTPC+组为60例，中位年龄为57.5岁，男28例，女32例。两组在性别和年龄上进行统计分析，结果无统计学差异（P＞0.05），具有可比性。

2 仪器与试剂 流式细胞仪：型号Navios（Beckman coulter公司，美国）。试剂：Kappa-FITC和Lambda-PE（Dako公司，丹麦），CD138-APC、CD38-APC750、CD45-KO、CD19-ECD、CD56-PC7、CD27-PB、CD81-APC700、CD117-PC5（Beckman coulter公司，美国），氯化铵溶血剂（QIAGEN公司，美国），破膜剂Intracell（Dako公司，丹麦）。

3 方法

3.1 十色流式细胞术：对初诊患者采集外周血和骨髓各2 mL，均采用EDTA-K2进行抗凝。取500 μL患者骨髓或外周血，按比例（1∶10）加入氯化铵溶血剂，漩涡振荡混匀，静置15 min；随后加入5 mL PBS，1 500 r/min离心5 min洗涤2次，去上清；洗涤后的细胞（50～100 μL）加入8种膜抗体（CD19-ECD、CD117-PC5、CD56-PC7、CD138-APC、CD81-APC700、CD38-APC750、CD27-PB、CD45-KO）并混匀，室温孵育15 min；加入100 μL固定剂A避光孵育15 min，用2 mL PBS 1 500 r/min离心5 min洗涤弃上清，先震荡混匀沉淀细胞，然后加入100 μL破膜剂B，轻轻吹打混匀后，加入胞质抗体（Kappa-FITC、Lambda-PE）轻轻混匀，室温避光孵育30 min后，2 mL PBS 1 500 r/min离心5 min洗涤弃上清，细胞沉淀中加入500 μL PBS重悬，上机检测。获取100万个白细胞，检测到单克隆浆细胞≥LOD值（最低检出限：2×10-5）为阳性。

3.2 细胞遗传学：对初诊患者的骨髓进行FISH细胞遗传学检测，检测主要包括IgH重排、1q21扩增、13q14扩增、p53缺失、Rb1缺失。如果在检测过程中出现IgH重排阳性，则需要加做t（4；14）、t（11；14）、t（14；16）。将出现1q21扩增、17p–、t（4；14）、t（14；16）定义为遗传学高危，而未出现以上遗传学改变的则定义为遗传标危。

4 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以GraphPad Prism5软件作图表示，采用卡方检验或Student.T检验对CTPC+组和CTPC–组的差异进行分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 分析CTPC与骨髓内肿瘤细胞比例的相关性 我们通过多参数十色流式细胞术对初诊MM患者外周血CTPC和骨髓中克隆性浆细胞进行免疫表型分析，以CD38++CD138+CD45±设门圈定浆细胞。通过细胞免疫表型将多克隆性浆细胞定义为阴性，单克隆性浆细胞定义为阳性，我们将75例患者分类为：CTPC-和CTPC+两组，CTPC–组为15例，CTPC+组为60例，CTPC阳性率为70.6%。首先，对CTPC+组CTPC（图1A）和BM（图1B）中克隆性浆细胞比例进行Pearson分析，结果显示，MM患者CTPC与BM中克隆性浆细胞比例呈正相关（γ=0.536 8，P＜0.000 1，图1C）。随后，我们又对CTPC-组BM和CTPC+组BM中克隆性浆细胞比例进行分析，结果显示两者比例无统计学差异（P=0.08，图1D）。以上结果表明，CTPC在PB中的比例与BM中浆细胞比例呈正相关，但是MM是否浸润外周系统与骨髓负荷无显著相关性，这可能与浆细胞的生物学特性或肿瘤微环境相关。

图1 分析CTPC与骨髓内肿瘤细胞比例的相关性

2 比较CPTC–组BM和CTPC+组BM克隆性浆细胞免疫表型的差异 为进一步探索MM侵袭外周系统的原因，我们对CPTC–组BM和CTPC+组BM中克隆性浆细胞表型进行分析。在CPTC–组BM克隆性浆细胞中，CD19阳性率为26.7%，CD56阳性率为86.7%，CD117阳性率为33.3%，CD81阳性率为53.3%。同时，在CTPC+组BM克隆性浆细胞中，CD19阳性率为5%，CD56阳性率为83.3%，CD117阳性率为13.3%，CD81阳性率为71.7%。对两组数据进行卡方检验分析，结果显示两组CD19和CD81表达具有统计学差异（P＜0.05），与CTPC-组相比，CTPC+组BM中克隆性浆细胞CD19表达降低，CD81表达升高（表1）。

表1 CTPC-组BM和CTPC+组BM克隆性浆细胞免疫表型的差异

3 比较CTPC+组PB和BM克隆性浆细胞免疫表型的差异 为进一步探索浸润外周的MM患者CTPC与原发骨髓中浆细胞免疫表型的差异，我们对CTPC+组中CTPC和BM中克隆性浆细胞进行免疫表型分析。CTPC+组CTPC中CD19阳性率为16.7%，CD56阳性率为81.7%，CD117阳性率为6.7%，CD81阳性率为71.7%。同时，在CTPC+组BM克隆性浆细胞中，CD19，CD56，CD117和CD81阳性率显示见表2。对两组数据进行卡方检验分析，结果显示两组Kappa，Lambda，CD19，CD56，CD81和CD117表达均无统计学差异（表2）。

表2 CTPC+组PB和BM克隆性浆细胞免疫表型的差异

4 CTPC阳性与预后相关指标的联系 为验证CTPC与多发性骨髓瘤预后的相关性，我们对两组患者的β2-MG、细胞遗传学以及CR之间的差异进行统计分析。结果显示，CTPC-组患者外周血中β2-MG的水平显著低于CTPC+组（图2，P=0.002），并且通过FISH检测多发性骨髓瘤相关遗传学改变，结果表明，CTPC–组患者骨髓遗传学高危组数目显著低于CTPC+组（CTPC–：6/14；CTPC+：51/53；P＜0.000 1）。通过对两组患者接受治疗后CR进行统计分析，结果显示CTPC-组和CTPC+组两组的CR没有统计学差异（CTPC–：7/12；CTPC+：16/50；P=0.09）。

图2 CTPC–组和CTPC+组外周血中β2-MG水平的差异

讨 论

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种B细胞源性的恶性增殖性血液系统疾病，由于早期临床症状不显著以及其灶性分布等特点，导致MM患者就诊时误诊率很高[4]。目前，循环肿瘤浆细胞（circle tumor plasma cell，CTPC）的存在和数量与肿瘤的诊断、判断预后和复发之间的联系成为MM研究的新方向[5，6]。有研究表明，CTPC参与肿瘤的转移与复发，LUZALBA等指出MM治疗后，出现CTPC反映了独特的肿瘤生物学特性（如肿瘤传播特性），并且提出CTPC可作为判断MM预后的一个独立连续监测指标[7]。本研究通过对两组预后相关指标进行统计分析，结果显示，CTPC–组的β2-MG血清水平和遗传学高危组数目显著低于CTPC+组，但是两组CR无显著差异。

目前，流式细胞术在MM中的应用价值已受到广泛认可，其主要应用于MM的鉴别诊断、预后标志物检测、靶标检测以及微小残留病灶的监测[8]。本研究对我院75例明确诊断的MM患者进行分组，以CTPC–为对照组，CTPC+作为实验组。并且，本研究对两组之间BM浆细胞表型的差异以及CTPC+组CTPC与骨髓肿瘤负荷之间的相关性进行统计分析。与CONSALVES等研究结果一致，本研究结果表明CTPC比例与BM中克隆性浆细胞比例呈正相关，可以反应骨髓肿瘤细胞负荷[9，10]。然而，CTPC+组与CTPC–组BM中克隆性浆细胞比例无显著差异，这表明MM是否浸润外周系统与骨髓负荷无相关性。随后，本研究对两组BM中克隆性浆细胞表型进行分析，结果显示CTPC+组CD19表达显著低于CTPC-组，而CTPC+组CD81表达显著高于CTPC–组。MAHMOUD等指出骨髓瘤系细胞CD19表达增强会阻滞细胞增殖，并且降低细胞致瘤性[10]，这与本研究结果一致。以上结果提示CD19低表达，CD81高表达可能是MM侵袭外周系统的特征之一。本研究结果还显示CTPC+组CTPC与BM中克隆性浆细胞表型Kappa，Lambda，CD19，CD56，CD81和CD117表达均无统计学差异。

综上所述，CTPC能够提示骨髓肿瘤细胞负荷，并且BM中克隆性浆细胞低表达CD19、高表达CD81与BM浸润外周具有相关性。与BM相比，CTPC的采集更为便捷，侵袭性更小，这推动了其在临床的广泛应用。在统计分析过程中，本研究发现虽然两者之间细胞表型总体无差异，但是个别病例CTPC与BM中克隆性浆细胞存在差异，这些不同表型的克隆性浆细胞是否可能是一个独立的预后指标需要进一步随访研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突