miR-146b-5p靶向ZNRF2影响IL-17a诱导乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭

王 娜 龚莉莉 叶春梅（武汉市妇女儿童医疗保健中心乳腺外科，武汉430014）

乳腺癌是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤，其异质性和转移性导致患者死亡率居高不下［1］。研究乳腺癌发生和转移的机制，对其精准治疗具有重要意义。

研究表明，IL-17a（interleukin-17a）在部分乳腺浸润性导管癌组织中高表达，体外可促进乳腺癌MCF-7细胞的侵袭［2］。IL-17在乳腺癌血清样本中高表达，可促进乳腺癌进展［3］。miR-146在乳腺癌患者中表达下调并与乳腺癌的发生和恶化有关［4］，miR-146b-5可通过靶向抑制IL-6表达抑制乳腺间质成纤维细胞的致癌作用［5］。ZNRF2与甲状腺乳头状癌的发生有关［6］，参与miR-100抑制人骨肉瘤细胞增殖和耐药过程［7］，且抑制ZNRF2表达可抑制非小细胞肺癌生长［8］。而ZNRF2在乳腺癌中的表达和作用尚不明确，其与miR-146b-5p和IL-17a在乳腺癌中是否存在关系还未可知。

本研究假设miR-146b-5p和ZNRF2参与IL-17a诱导乳腺癌进展的过程，以期为乳腺癌的靶向治疗提供新的研究靶点。

1 资料与方法

1.1 资料 选取本院病理科资料完整、诊断确切的女性乳腺癌手术切除癌症组织20例和正常癌旁组织20例，患者年龄23～68岁，平均（45.4±9.6）岁，术前未进行放疗、化疗及免疫治疗。人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自美国ATCC；DMEM高糖培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和四氮唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）购自美国Sigma-Aldrich公司；IL-17a抗体、ZNRF2抗体、MMP-2抗体、MMP-9抗体、STAT3抗体、p-STAT3抗体和β-actin抗体购自英国Abcam公司；引物、miR-146b-5p模拟物（miR-146b-5p）、miR-146b-5p抑制剂（anti-miR-146b-5p）、ZNRF2抑制物（si-ZNRF2）、阴性对照（miR-con、anti-miR-con、si-con）及双荧光素酶ZNRF2突变和野生型载体购自上海吉玛制药有限公司；双荧光素报告基因检测试剂盒酶购自上海碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂、Total RNA提取试剂盒、real-time PCR试剂盒、反转录试剂盒（RTPCR）购自美国Invitrogen公司；real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化测乳腺癌组织和癌旁组织中的IL-17a将乳腺癌组织和癌旁组织于4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，然后石蜡包埋、切片，按常规程序脱蜡和水化，再用3%H2O2灭活内源性过氧化物酶15 min，枸橼酸缓冲液进行抗原修复，10%血清37℃封闭30 min，加入1∶200的IL-17a一抗4℃孵育过夜，以PBS代替一抗作阴性对照，用PBS缓冲液冲洗3次×10 min，加入稀释的二抗，37℃孵育30 min，洗3次，加DAB显色液，避光显色，终止显色。苏木素衬染胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，37℃干燥48 h，显微镜观察并拍照。

1.2.2 细胞培养和IL-17a处理 细胞培养：配制含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM高糖培养液，将乳腺癌细胞MDA-MB-231培养于上述配制好的培养液，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。待细胞成长至对数生长期，用胰蛋白酶消化传代。

IL-17a处理：用培养液稀释对数生长期的MDAMB-231细 胞，以1×104个/孔 接 种于96孔板培 养24 h，然后在培养液中加入终浓度为0、10、50、100及300 μg/L的IL-17a，继续培养24 h、48 h或72 h，进行后续实验。对照组常规培养，培养液不添加IL-17a。

1.2.3 细胞转染 将稀释的MDA-MB-231细胞以2×105个/孔接种于6孔板，培养至细胞融合度为80%～90%时进行转染。根据转染试剂盒说明书操作，将无血清OptiMEM培养液稀释脂质体和各组片段及载体（包括miR-con、miR-146b-5p、anti-miRcon、anti-miR-146b-5p、si-ZNRF2、si-con、双荧光素酶报告系统载体），将稀释的脂质体和各组载体片段等体积轻柔混匀，室温孵育20 min后加入培养好的MDA-MB-231细胞中，混匀后培养6 h后，换成DMEM高糖完全培养基，转染48 h，收集细胞，验证转染效果。

1.2.4 Real-time PCR检 测miR-146b-5p和ZNRF2 mRNA表达 收集IL-17a处理后的对数生长期的MDA-MB-231细胞，根据RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，按照反转录PCR试剂盒操作要求进行cDNA合成，再以cDNA为模板按照real-time PCR说明书进行反应，合成miR-146b-5p和ZNRF2 mRNA。反应程序为：95℃2 min；94℃30 s、58℃40 s、72℃40 s，35个循环；72℃10 min。以2-ΔΔCt方法进行数据分析。

1.2.5 Western blot收集各组实验MDA-MB-231细胞，裂解细胞，收集蛋白并检测浓度。进行SDS-PAGE分离蛋白，转PVDF膜，室温封闭2 h，加入稀释的一抗，ZNRF2抗体（1∶2 000）、MMP-2抗体（1∶1 500）、抗MMP-9抗体（1∶1 000）、STAT3抗体（1∶5 000）、p-STAT3抗体（1∶2 000）和抗β-actin抗体（1∶3 000），4℃孵育过夜，PBST洗膜3次，然后加入稀释的二抗，室温孵育1 h，显影。以β-actin为内参照，分析蛋白表达水平。

1.2.6 MTT测定细胞活性 按照1.2.2的方法对MDA-MB-231细胞进行IL-17a处理，分别在培养至24 h、48 h、72 h时，每孔加入20 μl MTT溶液，培养4 h，弃上清，每孔再加入150 μl DMSO，室温振荡5 min，酶标仪测定OD490nm处吸光度（A）值。

1.2.7 Transwell检测细胞迁移和侵袭

1.2.7.1 迁移实验 将MDA-MB-231细胞培养至对数生长期，用无血清DMEM培养液稀释细胞至5×105个/ml。在Transwell上层加入100 μl稀释好的细胞，下层小室加入500 μl含10%FBS和IL-17a终浓度为100 μg/L的DMEM高糖培养基，培养72 h，弃去培养液，用棉签拭去上层小室未迁移的细胞，甲醛固定迁移的细胞30 min，结晶紫染色30 min，显微镜观察并计数迁移细胞。

1.2.7.2 侵袭实验 将Matrigel用4℃无血清培养基以1∶10比例稀释，加入上层小室，37℃烘干3 h，以下步骤同迁移实验，上层小室加入100 μl细胞，下层加入含10%FBS和IL-17a终浓度为100 μg/L的培养基，培养72 h，固定细胞，染色，计数。

1.2.8 双荧光素酶报告实验 将培养好的MDAMB-231细胞按照1.2.3步骤进行转染，将构建好的ZNRF2野生型（WT）和突变型（MUT）双荧光素酶报告载体分别与miR-con或miR-146b-5p共转染至培养好的细胞，转染48 h，收集细胞，验证转染效果，RIPA裂解液室温裂解转染后的细胞20 min，离心收集裂解上清，以海肾荧光素酶活性为内参照，计算萤火虫荧光素相对酶活性。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，数据均以±s表示。组间比较采用独立样本t检验和单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-17a在乳腺癌患者组织中高表达 检测20例乳腺癌肿瘤组织和癌旁组织，结果表明，与癌旁组织相比，在大多乳腺癌肿瘤组织中IL-17a的表达呈阳性（P＜0.05），见图1。说明IL-17在乳腺癌组织中高表达。

图1 乳腺癌组织及癌旁组织中IL-17的表达（免疫组化染色，×200）Fig.1 Expression of IL-17 in breast carcinoma tissue and adjacent tissues（IHC staining，×200）

2.2 IL-17a处理促进乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和转移 分别用终浓度为0、10、50、100和300 μg/L的IL-17a处理乳腺癌MDA-MB-231细胞株。结果表明，与对照组（0 μg/L）相比，经IL-17a处理后MDA-MB-231细胞增殖活性在48 h和72 h均明显升高（P＜0.05），迁移细胞数和侵袭细胞数均明显增多（P＜0.05），且呈剂量依赖趋势。说明IL-17a可促进MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭。根据实验结果和经济原则，后续实验选择100 μg/L的IL-17a处理细胞72 h（图2）。

图2 IL-17a处理促进乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭Fig.2 IL-17a treatment promoted proliferation，migration and invasion of breast cancer cell line MDAMB-231

2.3 IL-17a处理MDA-MB-231细胞抑制miR-146b-5p表达，促进ZNRF2表达 与对照组相比，IL-17a处理后MDA-MB-231细胞中miR-146b-5p的表达量明显降低（P＜0.05），ZNRF2蛋白和mRNA表达量均明显升高（P＜0.05），迁移侵袭蛋白MMP-2和MMP-9表达量明显升高（P＜0.05）。说明IL-17a处理MDAMB-231细胞可抑制细胞中miR-146b-5p表达并促进ZNRF2的表达（图3）。

图3 IL-17a处理MDA-MB-231细胞对miR-146b-5p、ZNRF2、MMP-2和MMP-9含量的影响Fig.3 Effects of IL-17a treatment on levels of miR-146b-5p，ZNRF2，MMP-2 and MMP-9 in MDA-MB-231 cells

2.4 miR-146b-5p靶向调控ZNRF2 ZNRF2的3'-UTR序列中含有与miR-146b-5p互补的核苷酸序列，见图4A。双荧光素酶报告系统结果如图4B所示，过表达miR-146b-5p时，WT型ZNRF2萤火虫荧光素酶相对活性明显降低（P＜0.05）；而MUT型ZN-RF2的萤火虫荧光素酶相对活性无明显变化。Western blot结果表明，过表达miR-146b-5p时ZNRF2蛋白表达量明显降低（P＜0.05）；抑制miR-146b-5p表达时ZNRF2蛋白表达量明显升高（P＜0.05），见图4C。

经检测，与癌旁组织相比，在20例乳腺癌组织中，miR-146b-5p含量明显降低（P＜0.05），ZNRF2蛋白含量明显升高（P＜0.05），IL-17a表达量与miR-146b-5p呈负相关，miR-146b-5p与ZNRF2含量呈负相关，见图4D～G。

2.5 IL-17a可逆转过表达miR-146b-5p对MDAMB-231细胞增殖、迁移和侵袭及STAT3信号通路的影响 结果显示，与Control组相比，IL-17a组MDAMB-231细胞增殖活性、迁移和侵袭数及细胞中ZNRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表达升高，磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白表达升高；与Control组或miR-con组相比，miR-146b-5p组MDA-MB-231细胞增殖活性、迁移和侵袭细胞数及细胞中ZNRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低（P＜0.05），p-STAT3蛋白表达降低（P＜0.05）；与miR-146b-5p组 相 比，IL-17a+miR-146b-5p组MDA-MB-231细胞增殖活性、迁移和侵袭细胞数及细胞中ZNRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表达升高（P＜0.05），p-STAT3蛋白表达升高（P＜0.05），见图5。说明IL-17a可逆转过表达miR-146b-5p对MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及STAT3信号通路的抑制作用。

图5 IL-17a可逆转过表达miR-146b-5p对MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭的影响Fig.5 IL-17a reversed effects of miR-146b-5p overexpression on proliferation，migration and invasion of MDA-MB-231 cells

2.6 IL-17a可逆转沉默ZNRF2对MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭及STAT3信号通路的影响 结果显示，与si-con组相比，si-ZNRF2组MDA-MB-231细胞增殖活性、迁移和侵袭细胞及细胞中NRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低（P＜0.05），p-STAT3蛋白表达量降低（P＜0.05）；与si-ZNRF2组相比，si-ZNRF2+IL-17a组MDA-MB-231细胞增殖活性、迁移和侵袭细胞及细胞中NRF2、MMP-2、MMP-9蛋白表达升高（P＜0.05），p-STAT3蛋白表达增加（P＜0.05），见图6。说明IL-17a可逆转沉默ZNRF2对MDAMB-231细胞增殖、迁移、侵袭及STAT3信号通路的抑制作用。

图6 IL-17a可逆转沉默ZNRF2对MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭及STAT3信号通路的影响Fig.6 IL-17a reversed effects of miR-146b-5p overexpression on STAT3 signaling pathway of MDA-MB-231 cells

3 讨论

IL-17由Th17细胞产生，可诱导细胞产生炎症效应物和抗微生物蛋白等因子，参与免疫性疾病和炎症的发生。近年研究表明，IL-17也在肿瘤中发挥促癌或抗癌效应［9-10］。IL-17a是IL-17家族成员之一，其单核苷酸多态性（SNPs）与中国女性患乳腺癌风险有关［11］，而IL-17与乳腺癌的侵袭和转移有关［12-13］。本研究结果发现，IL-17a在乳腺癌组织中呈阳性表达，IL-17a可在体外抑制乳腺癌细胞MDAMB-231的增殖、迁移和侵袭，与相关报道结果一致［14］，表明IL-17a可促进乳腺癌的发生发展。

miRNA是一类小分子非编码RNA，在真核生物体内广泛存在，参与调控细胞的增殖、凋亡和迁移等生物学过程，在癌症的发生发展中发挥重要作用［15］。研究显示，上调miR-146b-5p通过靶向抑制MMP-16表达降低肾癌细胞的增殖和侵袭能力［16］。姜黄素可通过上调miR-146b-5p表达抑制乳腺癌细胞转移，诱导细胞凋亡［17］。本研究结果表明，在乳腺癌组织中miR-146b-5p表达水平下降，过表达miR-146b-5p可抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭，与相关报道结果一致，表明miR-146b-5p作为抑癌基因参与乳腺癌的发生发展过程，是乳腺癌治疗的潜在分子靶点［18］。本研究还显示，IL-17a可抑制MDA-MB-231细胞中miR-146b-5p表达，过表达miR-146b-5p可降低IL-17a对MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用，与肖庆等［19］报道的IL-17a通过抑制miR-195-5p表达促进子宫内膜癌细胞增殖、迁移和侵袭的结果一致。

生物信息学预测结果发现，ZNRF2的3'-UTR序列中含有与miR-146b-5p互补的核苷酸序列，miR-146b-5p可能靶向调控ZNRF2表达。本研究通过双荧光素酶报告基因实验和Western blot证实了miR-146b-5p在乳腺癌MDA-MB-231细胞中靶向负调控ZNRF2表达，这也与IL-17a抑制MDA-MB-231细胞中miR-146b-5p表达，促进ZNRF2表达的结果一致。ZNRF2是环超家族E3泛素连接酶，可与细胞膜上的哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）协同作用感知氨基酸供应和调节细胞生长，在多种癌症中发挥作用［20］。但目前，ZNRF2在乳腺癌中的表达和作用尚不明确。本研究发现，ZNRF2在乳腺癌组织中表达上调，IL-17a可促进MDA-MB-231细胞中ZNRF2的表达，沉默ZNRF2可抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭，表明ZNRF2作为促癌基因参与乳腺癌的发生发展进程，靶向抑制其表达可延缓乳腺癌发展进程。

STAT3信号通路在多种恶性肿瘤中处于高度激活状态，参与肿瘤细胞的增殖和侵袭过程，如膀胱癌、肺癌［21-22］。本研究显示，IL-17a可激活乳腺癌细胞中STAT3信号通路，与相关报道结果一致［23］。本研究还显示，过表达miR-146b-5p或沉默ZNRF2可抑制IL-17a对乳腺癌细胞中STAT3信号通路的激活作用，进一步表明过表达miR-146b-5p可能通过负调控ZNRF2抑制STAT3信号通路的激活从而降低IL-17a对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响。

综上所述，IL-17a可促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，过表达miR-146b-5p可通过靶向抑制ZNRF2表达降低IL-17a对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用。