TUBB8基因突变致早期胚胎发育停滞一例

李文澍，刘雪梅

一次成功的临床妊娠需要经历卵母细胞成熟、精卵细胞融合及胚胎发育等过程，而减数分裂和有丝分裂的正常进行是卵母细胞成熟和早期胚胎正常发育的基础条件之一。在细胞分裂过程中同源染色体通过微管组织中心呈对称排列，在两极纺锤体的牵引下染色体分裂形成下一级细胞，而纺锤体组装及染色体分离都离不开微管蛋白的基础作用，其中TUBB8是一种特殊的微管蛋白亚型，在人类卵母细胞和早期胚胎细胞中发挥着重要作用[1-2]。既往研究表明TUBB8基因发生突变会导致卵母细胞成熟障碍、受精障碍和早期胚胎发育停滞等[3-4]。现报告1例TUBB8基因突变型导致患者反复早期胚胎发育停滞的临床病例。

1 病例报告

患者 女，36岁，因婚后未避孕未孕10年，于2018年10月7日就诊于我院生殖医学中心。平素月经规律，周期30 d。体质量指数（BMI）21.6 kg/m2，抗苗勒管激素（AMH）2.634 ng/mL（1 ng/mL=7.14 pmol/L）。基础性激素水平和甲状腺功能未见明显异常。子宫输卵管造影（HSG）示：宫腔显影正常，双侧输卵管显影，盆腔造影剂弥散局限。染色体核型为46，XX。2018年10月31日因超声发现宫腔内异常回声于我院行宫腔镜检查术+宫腔镜下子宫内膜息肉切除术，术中见：左侧输卵管开口处可见5 mm×3 mm息肉，宫腔前后壁遍布息肉样增生；术后病理回报为子宫内膜息肉。男方39岁，BMI25.1 kg/m2。精液常规示弱精子症、畸形精子症。染色体核型为46，XY。因甲状腺功能减退口服优甲乐治疗。双方均无不良生活习惯及嗜好，未从事生殖毒性的相关工作。

2018年12月—2019年12月患者于我院生殖医学中心进行了4个体外受精/卵细胞质内单精子注射（IVF/ICSI）周期的助孕治疗。①2018年12月24日行第1周期：控制性超促排卵（COH）方案采用拮抗剂方案，当有1个以上优势卵泡直径大于18 mm或2个以上优势卵泡直径大于17 mm时，肌内注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）6 000 IU扳机，34～36 h后取卵，共获卵4枚。男方当日因精液量少，精子浓度低，进行了2次取精，2次精液合并处理后行IVF受精。受精后2 h实验室观察见2枚卵母细胞排出第二极体，第2日（D2）观察未见2原核（2PN）的受精卵，第3日（D3）观察见2枚受精卵形成3细胞的胚胎，因未形成可移植胚胎取消周期。②2019年2月25日行第2周期：COH方案采用卵泡期长效长方案助孕，月经第3天给予促性腺激素释放激素激动剂（GnRHa，达菲林）3.75 mg肌内注射，注射后33 d超声及性激素检查示卵巢卵泡处于基础状态，每天给予FSH（丽申宝）300 IU及重组人生长激素4 IU。扳机后34～36 h取卵，共获卵8枚。IVF受精后2 h观察见5枚卵母细胞排出第二极体，D2观察未见2PN的受精卵，D3观察有2枚受精卵卵裂分别形成8细胞和5细胞的胚胎，移植后未孕。③2019年6月22日行第3周期：COH方案采用长方案助孕，扳机后34～36 h取卵，共获卵5枚。由于前2个周期IVF后见第二极体排出，但D2未观察到PN形成，因此本周期给予ICSI+卵母细胞激活助孕。D2实验室观察见5枚卵母细胞均形成2PN的受精卵，D3观察见其中4枚受精卵发生卵裂形成3～5细胞的卵裂期胚胎，移植1枚4细胞和1枚5细胞的胚胎后未孕，剩余2枚胚胎行囊胚培养未形成囊胚。④2019年11月27日行第4周期：COH方案采用拮抗剂方案，加用生长激素，采用肌内注射hCG4 000 IU+短效GnRHa（曲普瑞林）0.2 mg双扳机，34～36 h后取卵，共获卵8枚。本周期仍采用ICSI+卵母细胞激活助孕。D2实验室观察见8枚卵母细胞均形成2PN的受精卵，D3观察见7枚受精卵卵裂形成卵裂期胚胎，移植1枚8细胞和1枚4细胞的胚胎后未孕，剩余5枚胚胎行囊胚培养未形成囊胚。见表1。2020年6月对夫妇双方进行了全外显子的测序（复旦大学生命科学学院）。结果经Sanger测序确认女方存在TUBB8基因的杂合突变——TUBB8，c.208C>T/p.Pro70Ser，见图1；男方未发现突变基因。

表1 患者的IVF+ICSI临床结果

图1 TUBB8基因突变定位

2 讨论

该患者有10年不孕病史，在排除了其他不孕相关因素后，患者首先进行了2个周期的IVF治疗。无论是实施拮抗剂方案还是卵泡期长效长方案，患者虽有成熟卵母细胞形成，但在随后的受精及胚胎早期分裂结果均不理想。由于男方存在弱精子症、畸形精子症，首先考虑到精子质量影响胚胎质量的可能，遂更改方案，后2个周期采用ICSI方式，并加用了改善卵母细胞质量的相应措施。结果表明，成熟卵率与卵裂期胚胎形成率均得到改善，但最终所有胚胎的发育仍停滞在了8细胞期，并伴随胚胎碎片化。综合4个助孕周期，患者均能生成成熟卵母细胞，但存在卵母细胞受精障碍及早期胚胎发育停滞的情况，并通过查阅文献，追踪以往相似研究案例结果，可以得知存在于卵母细胞中的母体RNA与蛋白质在受精卵形成后仍会对胚胎发育有影响，母体基因突变可能是导致早期胚胎发育停滞的主要原因之一[5]，遂对患者及其配偶进行了全外显子的测序，由此发现了突变基因型TUBB8，c.208C>T/p.Pro70Ser。

在卵母细胞和早期胚胎中，TUBB8基因是微管蛋白系列最重要的表达基因之一，而在减数分裂和有丝分裂过程中纺锤体组装和染色体分离都离不开微管蛋白的基础作用[2]。TUBB8基因只存在于灵长类动物中，本身为高度保守的基因型，而基因错义突变会影响a/β微管蛋白等二聚体的折叠与组装，改变了体内微管蛋白的动力学，使纺锤体发生组装缺陷，并最终使卵母细胞和早期胚胎发育停滞[6]。文献报道目前已发现82种TUBB8变异基因型[7]，不同变异基因型会呈现不同的临床表型，包括：①形成的未成熟卵母细胞发育完全停滞；②形成无法受精的MⅡ期卵母细胞；③形成无法卵裂的受精卵；④形成的早期胚胎发育停滞；⑤形成外观正常但反复植入失败的胚胎[8]。大多数TUBB8致病变异基因型发生在中国[9]。本研究所阐述的TUBB8，c.208C>T/p.Pro70Ser的杂合子突变属于新发现的突变型，未在既往的文献中报道过，该基因型呈现的临床表型为早期胚胎发育停滞，无法进一步培养成正常的囊胚。

自从2016年Feng等[3]首次证明TUBB8基因突变会导致卵母细胞成熟障碍和早期胚胎发育障碍，此后有相关研究证明了TUBB8基因突变导致的早期胚胎发育停滞。研究表明某些TUBB8突变患者可以形成MⅡ期卵母细胞，且能正常受精和卵裂，但形成的所有胚胎发育都停滞在2细胞期～8细胞期[10-11]。推测患者早期胚胎发育停滞的原因可能是TUBB8基因突变影响了卵母细胞减数分裂中纺锤体的形成与组装，使染色体不均匀分裂，虽然有的卵母细胞可以成熟形成MⅡ期卵母细胞，但受精后可能形成非整倍体胚胎，导致胚胎无法继续正常发育[4，12]。Jia等[10]最新的研究阐述了另一种有关TUBB8基因突变导致胚胎发育停滞的机制，揭示了TUBB8基因中1个新的杂合突变（c.1041C>A；p.N347K），该突变可干扰有丝分裂纺锤体组装和染色体排列使早期胚胎发育停滞，该研究将人TUBB8突变基因型cDNA注入小鼠的2PN受精卵中，突变基因型TUBB8 cDNA直接阻断了受精卵的第一次有丝分裂，使97%的受精卵细胞无法形成功能正常的纺锤体，而在注射TUBB8正常基因型cDNA后纺锤体长度和胚胎形成率得到了明显改善。Yuan等[11]的研究亦指出TUBB8基因突变引起的微管缺陷可导致纺锤体排列不规则，进一步导致早期胚胎细胞第一次有丝分裂过程中卵裂球的不完全分离和Ⅱ型反向卵裂。

TUBB8基因外显子编码区测序结果发现以下变异位点

TUBB8基因突变相关疾病有2种遗传方式：父系起源的常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传。为进一步探知TUBB8变异来源，应检测女方的父母及兄弟姐妹的血样，但因患者为独生女，母亲已去世，父亲因身体等情况拒绝进行检测，因此未行相关检测，无法确定该基因型是新发的突变型还是遗传所致。

虽然现已发现了数十种致病的TUBB8基因突变型，但目前还缺乏有效的治疗方法。Jia等[10]的研究虽然提出正常基因型TUBB8 cDNA胞内注射可以改善小鼠细胞纺锤体的组装，并且注射后胚胎可以正常发育并产生活的后代，但小鼠早期胚胎分裂模式与人类不同，所以正常基因型TUBB8 cDNA胞内注射在人体内应用的安全性和有效性方面还缺乏实验论据支持。此外对生发泡置换、细胞质和纺锤体移植等进一步的研究可能会引发新的治疗思路，但目前都尚不成熟。Ca2+可能参与早期胚胎细胞有丝分裂，Ca2+促进了纺锤体微管的破裂，并调节染色体向两侧纺锤体极点移动[13]，因此有研究提出补充Ca2+可能对TUBB8基因突变引发的胚胎发育停滞有正向治疗作用的观点[12]。

综上所述，TUBB8基因在人类卵母细胞发育、受精和早期胚胎发育中发挥重要作用，基因突变会导致卵母细胞发育阻滞和早期胚胎发育停滞。本研究对有10年不孕史并反复IVF/ICSI助孕后早期胚胎发育停滞的患者进行了全外显子基因检测，发现了一种新的TUBB8基因突变型（c.208C>T/p.Pro70Ser）。该突变基因型导致胚胎发育停滞的具体作用机制还需进一步进行相关基础研究探讨。

志谢感谢复旦大学生命科学学院王磊教授和陈标榜老师的基因检测工作。