非优质D3剩余卵裂胚所形成囊胚的FET周期妊娠结局分析

李澎涛，王娜，郭战坤，殷晨星，孟娜娜，师楠，于晓光，李克用，王玉真

(保定市妇幼保健院生殖中心，保定 071000)

随着囊胚培养技术及玻璃化冷冻技术的发展，囊胚移植得以实现并广泛应用于临床。在囊胚培养的过程中发育潜能差或染色体异常的胚胎被淘汰，而且囊胚与子宫内膜发育阶段同步，因此囊胚移植具有更高的临床妊娠率、着床率，为单囊胚移植成为现实打下了基础，而单囊胚移植可显著降低多胎率，以缓解因多胎造成的各种风险[1-2]。影响囊胚形成及囊胚发育潜能的因素众多，例如患者年龄、原核期胚胎质量、卵裂期胚胎质量、培养环境等[3-5]，本研究探讨非优质D3剩余卵裂胚质量对继续囊胚培养的囊胚形成及其所形成囊胚发育潜能的影响，从而为临床选择更具有发育潜能的胚胎提供参考。

一、资料与方法

1.研究对象：2017年2月至2019年10月在保定市妇幼保健院生殖医学科接受IVF-ET治疗后非优质D3卵裂胚继续囊胚培养所形成囊胚的单囊胚FET周期及同期优质D3卵裂胚FET周期的患者。

纳入标准：(1)IVF-ET周期患者采用常规长方案控制性促排卵；(2)女方年龄24～34岁；(3)女方体重指数(BMI)18～25 kg/m2；(4)双方均无遗传性疾病；(5)复苏周期采用人工周期内膜准备方案；(6)优质D3卵裂胚FET周期或非优质D3剩余卵裂胚继续囊胚培养所形成囊胚的单囊胚FET周期。

排除标准：(1)血抗苗勒管激素(AMH)≤1.1 ng/ml、窦卵泡数(AFC)<6的卵巢功能减退患者；(2)子宫内膜异位症患者。

2.非优质D3剩余卵裂胚继续培养/冷冻及FET周期：纳入本研究的所有FET周期患者IVF-ET周期均采用常规长方案控制性促排卵，于HCG注射36 h后经阴道超声引导下取卵。利用G-seriesTM培养液培养胚胎至D3，依据ASEBIR卵裂期胚胎评价标准[6]对胚胎进行评价，根据细胞数、碎片率、均一度、多核/空泡表现及透明带状况等，将D3卵裂胚分为I～IV级，评级为Ⅰ级为优质卵裂胚；移植或冷冻后剩余非优质D3卵裂胚继续囊胚培养至D5/D6，依据Gardner囊胚分级法[7]对形成的囊胚进行评价，选择3期及以上且滋养层或内细胞团评级不同时为C的囊胚冷冻保存。

卵裂胚及囊胚的冷冻和解冻均使用日本Kitazato公司的冷冻及解冻套装。囊胚冷冻前均进行激光打孔皱缩。按照试剂说明书对胚胎进行冷冻及复苏，复苏后对卵裂胚透明带进行削薄、3/4期囊胚进行激光辅助孵化。

胚胎复苏后，在37℃、6%CO2培养箱内继续培养2 h后观察并记录解冻胚胎细胞的存活细胞数、坏死细胞数及继续培养后的生长情况。复苏后3～4 h，用移植管连接BD1 ml气密注射器，一段式装管后，B超引导下将胚胎移植入子宫腔中后部。解冻D3优质卵裂胚移植1～2枚，囊胚择优行单囊胚移植。胚胎移植后35 d腹部B超观察到宫腔内孕囊及心管搏动为临床妊娠。

3.研究分组：依据继续囊胚培养的非优质D3剩余卵裂胚质量分为A组(Ⅱ级D3剩余卵裂胚组)、B组(Ⅲ级D3剩余卵裂胚组)、C组(Ⅳ级D3剩余卵裂胚组)，所形成的囊胚FET周期依次为A1、B1、C1组。另以优质D3卵裂胚(I级)FET周期为移植结局对照组(D组)。

4.观察指标及判定标准：囊胚形成率=D5/D6形成的2期以上囊胚数/继续培养胚胎数×100%；优质囊胚形成率=D5/D6形成的优质囊胚数/继续培养胚胎数×100%；可利用囊胚形成率=D5/D6形成的可利用囊胚数/继续培养胚胎数×100%；临床妊娠率=超声下能检测到孕囊的妊娠周期数/移植周期数×100%；着床率=超声下检测到的孕囊数/移植胚胎数×100%；早期流产率=孕周<12周的流产周期数/临床妊娠周期数×100%；异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%。

二、结果

1.D3剩余胚胎继续囊胚培养结局：继续培养的非优质D3剩余卵裂胚共3 015枚，其中Ⅱ级D3剩余卵裂胚515枚、Ⅲ级D3剩余卵裂胚1 664枚、Ⅳ级D3剩余卵裂胚836枚；共形成囊胚1 317枚，其中可利用囊胚963枚、优质囊胚474枚。

随着D3剩余卵裂胚质量下降，继续囊胚培养卵裂胚的囊胚形成率、D5/D6可利用囊胚形成率、优质囊胚形成率均显著下降(P<0.01)(表1)。

表1 D3剩余胚胎继续囊胚培养结局比较[n(%)]

2.FET周期临床结局：本研究比较了不同质量的非优质D3剩余卵裂胚继续囊胚培养所形成囊胚的单囊胚FET结局，共264个单囊胚FET周期，其中A1组116周期、B1组82周期、C1组66周期。并且与同期D3优质卵裂胚FET的79周期(D组)进行比较。

患者基本情况：各组间患者年龄、不孕年限、BMI、既往周期数、基础FSH值和移植日子宫内膜厚度等比较，均无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 FET周期各组患者基本情况比较(-±s)

临床结局：C1组移植D5囊胚比例显著低于A1、B1组(P<0.05)，临床妊娠率亦显著低于A1、B1组(P<0.05)；A1、B1组着床率显著高于C1、D组(P<0.05)；C1组活产率显著低于A1组(P<0.05)。早期流产率、异位妊娠率各组间无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表3 FET周期各组患者妊娠结局的比较(%)

三、讨论

囊胚培养越过了胚胎基因组激活阶段，一些发育潜能差及染色体异常的胚胎在囊胚培养过程中被淘汰，从而提高了移植周期临床妊娠率及胚胎着床率[7]，并且囊胚比卵裂期胚胎冷冻效果更好[8]。随着囊胚培养及玻璃化冷冻技术在辅助生殖领域的发展，囊胚冷冻、囊胚移植在很多生殖中心得到广泛应用。尽管囊胚移植具有以上众多优势，但影响囊胚形成及其移植结局的因素众多，本文主要就非优质D3剩余卵裂胚质量对继续囊胚培养卵裂胚的囊胚形成及其所形成囊胚发育潜能的影响进行了探讨分析。

章志琴等[3]对D3剩余胚胎囊胚培养，采用Logistic逐步回归法对影响优质囊胚形成率的相关因素进行了分析，该研究认为D2卵裂球数4个的胚胎继续囊胚培养的优质囊胚形成率显著高于少于卵裂球数4个的胚胎，随着D3卵裂球数的增多，优质囊胚形成率也随之升高，但8个卵裂球的胚胎的优质囊胚形成率优于9～10个卵裂球的胚胎；胚胎碎片、空泡及多核对优质囊胚的形成有负面影响。Kong等[9]利用Time-Lapse研究了细胞数、细胞破碎、卵裂方式与胚胎发育潜能之间的关系，发现细胞破碎的发生会导致D3细胞数数目减少，但在≥7细胞的胚胎中细胞碎片的发生率明显减少，囊胚形成率及优质囊胚形成率随着细胞数的增加而增加，但7～8细胞时囊胚形成率及优质囊胚形成率是所有分组中最高的；胚胎卵裂方式亦是影响胚胎发育潜能的一个重要因素，那些非平衡性卵裂即一个卵裂球直接分裂成3个或者更多细胞的胚胎，当卵裂细胞数≥5细胞时，胚胎发育潜能明显降低。在细胞数5～6细胞时，相较于细胞碎片非平衡性卵裂对囊胚的形成影响更大，但在7～8细胞大多表现正常卵裂，虽然非平衡性卵裂也降低了胚胎发育潜能，但它们之间的比较无统计学差异。胚胎的发育与胚胎的非整倍体率密切相关，胚胎的非整倍体率影响胚胎发育速度、内细胞及滋养层形态[10]，施文浩等[11]对D3卵裂期胚胎进行PGS分析发现，卵裂期胚胎评价参数中胚胎的碎片体积比例低的胚胎整倍体率较高。本研究依据ASEBIR卵裂期胚胎评价标准综合了D3卵裂胚细胞数、碎片率、均一度、多核/空泡表现及透明带状况等对胚胎评级，不同质量非优质D3卵裂胚继续囊胚培养，得出与以上等研究相似的结果，即随着D3剩余卵裂胚质量的降低，继续囊胚培养的囊胚形成率、D5/6可利用囊胚形成率、优质囊胚形成率亦显著下降。

那么这些非优质D3剩余卵裂胚形成的囊胚发育潜能如何呢？Urman等[12]认为D3胚胎质量虽然影响囊胚形成率，但对所形成的囊胚质量及其发育潜能没有关系。但Kong等[9]的研究发现≥7细胞的卵裂期胚胎，整倍体率高，发育速度较之细胞数<7的胚胎要快一些，D5形成的囊胚比例高于后者，而移植D5囊胚的临床结局明显优于D6囊胚[13-14]，这与本研究中FET周期由于Ⅱ/Ⅲ级D3剩余卵裂胚形成的D5囊胚移植比例高于Ⅳ级D3剩余卵裂胚形成的D5囊胚移植比例，导致前者的妊娠结局优于后者的情况相符。在郭映纯等[15]的研究中认为非优质卵裂期胚胎即使形成囊胚移植后的妊娠结局并不乐观，而在本研究中Ⅲ级D3剩余卵裂胚所形成囊胚的单囊胚FET仍能获得较好的妊娠结局，分析其原因是由于两个研究所采用的卵裂期评分标准不一样，本研究评分结合了D2和D3胚胎卵裂球数的发育速度均衡性，导致整体胚胎评分较低，Ⅲ/Ⅳ级胚胎比例偏高，造成了两份研究结论的偏差。

在本研究中Ⅳ级D3剩余卵裂胚形成囊胚的单囊胚FET活产率显著低于Ⅱ级D3剩余卵裂胚形成的囊胚，分析其原因可能是即使胚胎发育至囊胚仍有36%非整倍体率发生，低质量卵裂期胚胎所形成囊胚的非整倍体发生率高于高质量卵裂期胚胎所形成的囊胚[16]，导致即使形成了囊胚，其发育潜能亦会较差。

本研究中Ⅱ/Ⅲ级D3剩余卵裂胚所形成囊胚的单囊胚FET着床率显著高于优质D3卵裂胚FET着床率，此结果与邹敏等[17]的研究一致，其研究认为D3剩余卵裂胚继续囊胚培养至D5形成的囊胚FET周期临床妊娠率、着床率显著高于优质D3卵裂胚及D6形成的囊胚FET周期的临床妊娠率、着床率，而优质D3卵裂胚与D6形成的囊胚的FET周期妊娠率、着床率无统计学差异。

综上所述，剩余D3卵裂胚质量对囊胚的形成及其发育潜能有着一定的预测价值，在以往的大多文章中就影响囊胚形成的独立因素如年龄、卵裂球数量、碎片比例、均一程度等分别进行了研究，本研究将患者年龄限制在24～34岁，排除了年龄因素的干扰，同时将卵裂球数量、碎片比例等因素综合起来评价卵裂期胚胎质量，从而分析D3剩余卵裂胚质量对卵裂胚的囊胚形成及其所形成囊胚发育潜能的影响，选择出更具有发育潜能的囊胚。与优质D3卵裂胚FET周期相比，Ⅱ/Ⅲ级D3剩余卵裂胚所形成囊胚的单囊胚FET能够获得更高的着床率，即使Ⅳ级D3剩余卵裂胚所形成囊胚的单囊胚FET也能获得与优质D3卵裂胚FET相近的妊娠结局，因此优先选择移植评分高的D3剩余卵裂胚形成的囊胚移植，可以提高胚胎移植效率，同时减少了促排卵等相关操作，极大降低了对患者身心健康损害及患者医疗费用。